生产商陆皂甙药用活性成分的方法技术

一种生产商陆皂甙药用活性成分的方法属于医药技术、生物技术领域。方法如下：（１）以萌发７天的子叶和胚轴作诱导材料进行转化；（２）外植体在菌液中浸染并用无菌水洗涤后转入暗处共培养２天；（３）利用在含头孢噻肟钠的培养基上至少要经过５次以上继代培养除菌的方法将农杆菌除净，或者采用高温除菌法，即将毛状根转至３９．５℃的恒温箱中培养４８ｈ；（４）将毛状根逐一分开，在１／２ＭＳ培养液中进行大量培养，生产商陆皂甙和商陆多糖。本发明专利技术具有实质性特点和显著进步，利用本发明专利技术将商陆毛状根代替商陆药材或从毛状根中提纯商陆皂甙供应市场。优点是产量高，含量稳定，且不受气候、土地等自然条件的限制，对解决中药商陆的资源紧缺、满足医药工业生产需要具有重要意义。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，公开了一种利用商陆毛状根及其培养液进行商陆皂甙药用活性成分的生产方法，属于医药技术、生物

技术介绍
商陆(Phytolacca acinosa Roxb)为商陆科植物，其根为重要的中药，我国大部分地区均产。商陆始载于“神农本草经”，因其有毒被列为下品。临床多用于水肿胀满、二便不通，外治痛肿疮毒。现代药理研究表明商陆皂甙具有激活核苷酸还原酶的活性，商陆总皂甙可诱生R干扰素，糖蛋白对骨髓瘤细胞的DNA合成有抑制作用，商陆多糖I(PEP-1)能促进淋巴细胞增殖和产生白细胞介素-2(IL-2)以及增强巨噬细胞的吞噬功能。发根农杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，感染植物后可将其Ri质粒上的T-DNA转化并整合到植物基因组，表达产生毛状根，毛状根生长快速，能合成植物根中特有的次生代谢产物。近年来，利用发根农杆菌Ri质粒转化植物产生的毛状根建立离体培养系统，实现次生代谢产物的工业化生产以解决中药资源的短缺问题也越来越受到人们的重视。相对于常规细胞培养和组织培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。通过改变培养条件，毛状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质。目前，商陆皂甙、商陆多糖为主要成分的新药均已被开发出来供应市场，因此对商陆药材的需求日益增多。经文献检索发现孙敏等作者在西南师范大学学报(自然科学版)，2002，27(4)549-552发表“长春花转化毛状根诱导及培养条件的优化”一文，文中描述了采用A4和R1000两种发根农杆菌分别感染长春花的愈伤组织、叶片、叶柄及根，诱导出了毛状根，并考察了不同种类的培养基、碳源、氮源等因素对毛状根生长的影响，得到了毛状根生长的较佳条件。但该方法在诱导效率、除菌方法等方面存在着若干不足之处，并且未考察毛状根中活性成分的含量及未筛选高含量活性成分的株系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种。使用活化了的A4、R1000和C58C1三种发根农杆菌分别感染商陆的萌发7天的子叶及胚轴，诱导出了毛状根，并根据不同种类的培养基、碳源、氮源等因素对毛状根生长的影响，得到了毛状根生长的较佳条件，本专利技术开辟了一个再生商陆资源的新途径，为工厂化生产商陆皂甙等药用活性成分奠定了基础。本专利技术经筛选得到的优质株系生长速度快，24天培养干重增长23倍，商陆皂甙含量0.56％，商陆多糖含量12.7％。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术的方法如下1、以萌发7天的叶片、子叶、胚轴及根和愈伤组织作诱导材料，子叶和胚轴的诱导效果较好，叶片的诱导率很低，而根和愈伤组织不能诱导出毛状根；2、外植体在菌液中浸染并用无菌水洗涤后转入暗处共培养2天，转化效率较高，而在光照的条件下不能诱导出毛状根；3、利用在含头孢噻肟钠的培养基上继代培养除菌的方法除菌的方法，不过周期太长，至少要继代5次以上才能将农杆菌除净，或者采用高温除菌法，即将毛状根转至39.5℃的恒温箱中培养48h，大大加快了进程；4、将毛状根逐一分开，在1/2MS培养液中进行大量培养，生产商陆皂甙和商陆多糖。以下对本专利技术的技术方案作进一步的说明1、发根农杆菌的活化将三种发根农杆菌菌株A4，R1600，C58C1于-20℃保存在灭菌甘油中，临用前于YEB固体培养基、25℃活化3次，然后转至YEB培养液(培养液中加入200mg/L卡那霉素)于黑暗、25℃、100r/min振荡培养，约12h后测定菌液在600nm的吸光度(OD600值)，当OD600值为0.8时，用于感染外植体。2、植物材料取商陆种子，用浓硫酸浸泡2小时后用清水洗净，在75％乙醇中浸泡1min，用清水冲净乙醇，再用0.1％HgCl2消毒15min，无菌水冲洗5次，置于MS培养基上，25℃，光照12h/d，光强度2000lx，15d后萌发。取生长7d左右的无菌苗的子叶和胚轴作为外植体，于MS培养基上预培养24h后用于转化。3、外植体的转化将上述预培养的外植体分别浸入OD600值为0.8的发根农杆菌A4，R1600，C58C1菌液中，在黑暗条件下120r/min振摇10min，取出，用无菌滤纸吸干多余的菌液，在暗处、MS培养基上共培养24h后移至含300 mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上培养，25℃，光照12h/d，光强度2000lx，并以未经感染的子叶和胚轴作对照。4、毛状根的除菌将感染后长出的毛状根剪下移到新的含300mg/L头孢噻肟钠的MS固体培养基上培养，每7d转接1次，转接4次以后，将毛状根转至39.5℃的恒温箱中培养48h，随后转入不含抗生素的MS培养基上。5、毛状根优质株系的筛选将MS培养基上的毛状根逐一分开，挑取2cm左右者移入1/2MS培养液中，35ml培养液/50ml三角锥瓶，每瓶一根，20d后观察生长情况，挑选生长迅速的进行继代培养。6、PCR及高压纸电泳检测PCR法按SDS法提取毛状根的DNA。rolB及rolC基因是发根农杆菌中与转化有关的关键基因，分别设计合成这两个基因的引物。rolB基因的引物为5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’和5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’，预期产物长度为423bp，rolC基因的引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’和5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’，预期产物长度为626bp。PCR反应体系为25μl(50ng基因组DNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.25单位Taq DNA聚合酶，25pmol引物)。反应条件为94℃变性3分钟，35个循环(94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分钟)，最后72℃延伸7分钟。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳(80V电压，40分钟)后，在UVP成像系统上观察DNA条带并拍照。以相应的农杆菌菌株为阳性对照，以未转化的商陆根为阴性对照。高压纸电泳法分别取3种农杆菌感染获得的毛状根各100mg置于1mlEppendorf管，加入0.1mol/L HCl 100μl，捣成匀浆，4℃浸提2h，1.5 10r/m离心5min，取上清液10μl点样于Whatman 3MM滤纸上进行高压纸电泳(400V，30mA)，电泳缓冲液为HCOOH∶CH3COOH∶H2O(5∶15∶80)。40min后将滤纸取出晾干，均匀浸入碱性硝酸银溶液(0.625g AgNO3溶于50ml丙酮)中染色1min，晾干后再浸入10ml 20％NaOH+90ml 95％乙醇混合液中显影5min，最后再经5％硫代硫酸钠溶液中退色20min，晾干后拍照。以试管苗的正常根为阴性对照，甘露碱标准品(1mg/ml)或胭脂碱标准品(1mg/ml)为阳性对照，检测到的阳性株系即我们所需要的毛状根。7、毛状根生长曲线的测定取毛状根的优质株系在1/2MS培养液中进行测定，35ml培养液/50ml三角锥瓶，共50瓶，每4d测1次干质量，每次测5瓶，以平均干质量为指标绘制生长曲线。干质量系60℃烘24h至恒重后测得。1.8毛状根生长条件的优化分别配制以蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产商陆皂甙药用活性成分的方法，其特征在于，方法如下：（１）以萌发７天的子叶和胚轴作诱导材料；（２）外植体在农杆菌菌液中浸染并用无菌水洗涤后转入暗处共培养２天，随后转入筛选培养基进行筛选培养；（３）利用在含头孢噻肟钠的培养基 上至少要５次以上继代培养除菌的方法将农杆菌除净，或者采用高温除菌法，即将毛状根转至３９．５℃的恒温箱中培养４８ｈ；（４）将毛状根逐一分开，在１／２ＭＳ培养液中进行大量培养，生产商陆皂甙和商陆多糖。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许铁峰，唐克轩，张汉明，张磊，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]