一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体制造技术

对肠激酶轻链基因第１１２位的半胱氨酸定点突变，用大肠杆菌和酵母表达肠激酶轻链变体，经Ｚｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ＳＴＩ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，获得高纯度的肠激酶轻链变体蛋白。与野生型肠激酶轻链相比，该变体具有较高的稳定性和酶活性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种丝氨酸蛋白水解酶，特别是肠激酶的轻链变体。
技术介绍
肠激酶(Enterokinase，EK)是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一。在生理条件下，锚定在细胞膜上的EK将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶，胰蛋白酶再激活胰腺中的其他酶原进而形成一系列的蛋白水解酶混合物。肠激酶由两条多肽链组成，即重链和轻链，并通过一对链间二硫键连接，其中轻链中的Cys112参与了和重链的连接。肠激酶的轻链具有完整的催化功能，其识别序列是 肠激酶对其识别序列具有高度的专一性，目前广泛应用于切割融合蛋白中载体蛋白和目标蛋白之间的肽键，因为P1′位点的氨基酸残基对肠激酶的专一性及活性影响甚微。此外，融合蛋白经EK酶解获得的目标蛋白具有和野生型完全一致的氨基酸序列。但目前市售的肠激酶价格非常昂贵，其中从组织中分离纯化的肠激酶往往存在其它蛋白酶类的污染，而通过基因工程制备的野生型肠激酶轻链(EKLC)稳定性较差，长时间保存容易产生聚合体或沉淀，导致酶活性下降。我们认为肠激酶轻链分子中游离存在的Cys112能够引起肠激酶轻链分子间的聚合，并导致酶活性的降低。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用基因工程技术，克隆肠激酶轻链基因并对Cys112密码子进行定点突变，再分别装入原核或真核细胞表达载体，并采用原核或真核细胞发酵的方式获得稳定性和酶活性高的肠激酶轻链变体蛋白。本专利技术的技术解决方案一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，它用原核或真核细胞制备，其特征是通过基因工程方法，对肠激酶轻链蛋白第112位的半胱氨酸残基定点突变；最终的活性酶产物中没有游离的半胱氨酸残基，并使酶的稳定性及活性提高。本专利技术的优点1.对肠激酶轻链变体在原核或真核细胞中的表达产物采用Zn-Sepharose亲和层析进行纯化，方法简单，成本低。2.当采用原核细胞制备肠激酶轻链或其变体时，肠激酶轻链变体的活性回收高于对应的野生型肠激酶轻链。3.制备的肠激酶轻链变体对小分子底物的水解活性略高于野生型肠激酶轻链，且具有更高的酶学稳定性，表现为在与融合蛋白长时间保温后(＞10hr)，相同活性单位的肠激酶轻链变体对融合蛋白的酶解作用显著高于对应的野生型肠激酶轻链。附图说明图1是从酵母制备的野生型肠激酶轻链和肠激酶轻链变体对硫氧化还原蛋白-人脑钠素融合蛋白的酶解作用的电泳图谱。图2是从大肠杆菌制备的野生型肠激酶轻链和肠激酶轻链变体对硫氧化还原蛋白-人脑钠素融合蛋白的酶解作用的电泳图谱。图3是用酵母菌制备的野生型肠激酶轻链及其变体形成二聚体的电泳图谱。具体实施例方式本专利技术是通过以下方式实现的1.十二指肠总RNA的制备，取新鲜的牛或人的十二指肠组织，按照Qigen kit(Catalog NO.74104)操作手册提取总RNA。2.RT-PCR反应RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司，(Catalog No.L1310-01)实验过程参照操作手册。取3μg总RNA，加水至终体积11.5μl，再加入1μl胸腺嘧啶寡核苷酸引物，混匀，置65℃保温10min，室温2min，再依次加入1μl RNase抑制剂，4μl 5x反应缓冲液，1μl 100mM dNTP，1μl 80mM焦磷酸钠，0.5μl AMV反转录酶，混匀置42℃反应60min。取3μl上述反应液作为PCR扩增模板。当采用原核细胞作为表达宿主菌时，PCR扩增的5′端引物为CAT ATG GAC GAC GAT GACAAG ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC，3′端引物为CTC GAGATG TAG AAA ACT TTG TAT CCA CTC；当采用酵母作为表达宿主菌时，PCR扩增的5′端引物为CTC GAG AAA AGA ATT GTC GGA 30个循环GGA AGT GAC TCC，3′端引物为GTC GAC ATG TAG AAA ACTTTG TAT CCA CTC(注3′端引物中均不含终止密码子，而是采用表达载体上的6个多聚组氨酸及其终止密码)，再分别加入50pmol 5′端和3′端引物，5μl 10x的PCR缓冲液，5μl 10mM dNTP以及0.25U Taq酶，并用H2O定容到50μl。PCR扩增的条件为3.肠激酶轻链基因克隆质粒(PCR2.1EKLC)的构建将PCR扩增产物直接连接到PCR2.1载体上(Invitrogen公司产品，Catalog No.K2040-40)。取3μl PCR扩增产物，加入1μl PCR2.1载体，1μl盐溶液，1μl水，置室温连接4min。取3μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，用EcoRI酶切筛选阳性克隆，并进一步进行序列鉴定。4.肠激酶轻链Cys112的定点突变(PCR2.1EKLC/Cys112→Ala)采用Stratagene公司的定点突变试剂盒进行Cys112的定点突变(Catalog No.200518)。突变引物为①GAT TAC ATA CAA CCT ATT GCT TTA CCG GAA GAA AATCAA②TTG ATT TTC TTC CGG TAA AGC AAT AGG TTG TAT GTAATC取PCR 2.1EKLC质粒200ng，分别加入50pmol引物1和2，5μl10x的扩增缓冲液，5μl 25mM dNTP，以及0.5u的Pfu酶，并用水定容到50μl。扩增条件为 18循环扩增完毕，加入1μl DpnI置37℃反应1小时。取3μl上述反应溶液转化JM109感受态细胞。在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂板上挑取菌落，并进行序列测定验证。在对肠激酶蛋白序列的112位半胱氨酸残基进行点突变时，或保留其基因序列或蛋白序列的其他位点的野生型，或同时对肠激酶的基因序列或蛋白序列的其他单一位点或多位点进行突变或缺失或插入，都能达到本专利技术的效果。5.肠激酶轻链变体基因表达载体的构建在构建原核细胞表达质粒时，将PCR2.1EKLC/Cys112→Ala质粒和表达载体PET29b用NdeI/XhoI双酶切。PCR2.1EKLC/Cys112→Ala质粒酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化小片段。PET29b酶切产物则纯化回收大片段。取上述两片段各8.5μl，加入2μl10x的连接缓冲液和1μl的连接酶，置15℃连接过夜。取5μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含卡那霉素的琼脂板上挑取菌落，并用NdeI/XhoI酶切筛选阳性克隆(PET29bEKLC/Cys112→Ala)。在构建酵母表达系统时，将PCR2.1EKLC/Cys112→Ala质粒和表达载体pPICZαA用XhoI/AccI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后，PCR2.1EKLC/Cys112→Ala质粒酶切产物纯化回收小片段，pPICZαA酶切产物纯化回收大片段。各取8.5μl上述片段混合，加入2μl连接缓冲液和1μl连接酶，置15℃连接过夜，取5μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含Zeocin的低盐LB琼脂平板上挑取菌落，用XhoI/AccI酶切筛选阳性克隆(pPICZαA EKLC/Cys112→Ala)。6.工程菌的建立①以大肠杆菌为宿主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，它用原核或真核细胞制备，其特征是通过基因工程方法，对肠激酶轻链蛋白第１１２位的半胱氨酸残基（Ｃｙｓ）定点突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙自勇，刘建宁，
申请(专利权)人：刘建宁，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]