重组人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的构建、表达与纯化方法技术

技术编号:1719496 阅读:161 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及医药生物工程技术领域,是包括涉及编码人甲状旁腺激素小肽的cDNA,和利用其表达载体制备人甲状旁腺激素的方法。本发明专利技术将化学合成的重组人甲状旁腺激素(1-34)基因用PCR扩增后,克隆至表达载体pET-35b(+),使重组人甲状旁腺激素(1-34)融合于纤维素结合结构域(CBD↓[clos])的羧基端,并得到高效表达。融合蛋白经纤维素树脂亲和层析纯化后,经Factor  Xa裂解释放出rhPTH(1-34),再通过纤维素树脂亲和层析、C4反向高效液相色谱纯化得到rhPTH(1-34)纯品。每升培养液可获取3mg高纯度的rhPTH(1-34)。经质谱测定,所得样品的分子量为4117.0道尔顿,与rhPTH(1-34)理论分子量一致。本发明专利技术极大程度上丰富了该多肽在医药生物工程技术领域的研究和开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物工程
,是包括涉及编码人甲状旁腺激素小肽的cDNA,和利用其表达载体制备人甲状旁腺激素的方法。
技术介绍
甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)是由甲状旁腺的主细胞合成并分泌的一种直链多肽。最初合成的是含115个氨基酸的前甲状旁腺素原(prepro-PTH),在粗面内质网内去掉N-端25个氨基酸残基形成甲状旁腺素原(pro-PTH),后者再在高尔基体内从N-端去掉一个六肽,形成含84个氨基酸的PTH。PTH是调节血钙水平的重要激素,其分泌主要受血钙浓度的调节,血钙浓度的轻微降低直接刺激甲状旁腺分泌PTH,血钙浓度升高时PTH分泌则减少。PTH可刺激骨吸收,使钙、磷从骨骼中释放入血;促进肾小管对钙重吸收、抑制磷重吸收,促进25-(OH)D3在肾脏内向1,25-(OH)2D3转化;而1,25-(OH)2D3促进肠道对钙、磷的重吸收,以上作用的共同结果是升高血钙及降低血磷。另一方面,除促进破骨细胞骨吸收之外,PTH还能引起成骨细胞数目的增加,刺激骨形成,这一特点使得PTH作为骨质疏松症治疗及预防性药物受到关注。PTH的受体结合区从His14到Phe34,氨基端是活性端,与靶组织受体结合后引起一系列生物效应,羧基端不具有活性。研究表明,在体内,PTH氨基端的1至34氨基酸片段即具有完全的生物活性。Oldenburg KR等人曾报道将rhPTH(1-34)变体串联成八聚体在E.coli中高表达,为了用CNBr将八聚体切割成单体,他们将hPTH(1-34)野生序列包含的可被CNBr作用Met残基突变为Leu,正常人hPTH第35位为Glu因而Oldenburg KR等人研制的是hPTH变体,且反应条件剧烈又有剧毒。Zhaoyang X及其同伴报道了将rhPTH(1-34)克隆入GST融合表达系统,融合蛋白经凝血酶(thrombin)切割后,再用脯氨酰肽链内切酶(PEPase)去掉氨基端多余的残基,可得到rhPTH(1-34)。修朝阳等(2002年)构建的GST-PTH融合蛋白表达系统,其GST-PTH融合蛋白的表达效率为25%,与我们的表达菌株的表达效率相当,但由于PTH在GST-PTH融合蛋白中仅占1/9(GST的分子量为26kd),而PTH在CBDcols-PTH融合蛋白中占1/5,因此我们的表达菌的PTH表达效率实际上高于修朝阳等构建的菌株。Suzuki等(1998年)构建了PTH与半乳糖苷酶片段形成的融合蛋白表达系统,并用Kex2蛋白酶水解融合蛋白。其融合蛋白的表达效率仅为20%,且表达的融合蛋白主要是以包涵体的形式存在,需经复性处理。此外,为维持融合蛋白的溶解性,融合蛋白的酶解和PTH的纯化均须在3M的尿素中进行。由于Kex2蛋白酶价格昂贵且它在3M尿素存在时活性下降50%,因此,生产工艺的成本比较高。由于PHT在制备过程中长时间暴露在含尿素的溶液中,容易受到自由基引起的化学修饰和活性变化。与Suzuki等的生产工艺相比,我们构建的CBDclos-PTH菌株的表达效率超过25%,且CBDclos-PTH融合蛋白主要以可溶形式存在,避免了复性步骤。此外,融合蛋白的裂解是在Factor Xa的最佳水解条件下进行,因此,酶解效率高,且酶用量低。我们在rhPTH的制备过程中采用两步亲和层析分别纯化CBDclos-PTH融合蛋白和rhPTH,纯化步骤简单。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题,提出一种。本专利技术的技术解决方案一种,其特征在于a.重组人甲状旁腺激素的构建以下述基因序列为模板,CCGCGGGT TCCGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTACACAACTTCTAACTCGAG,实线处分别为SacII、XhoI的酶切位点,虚线处序列编码Factor Xa识别位点Ile-Glu-Gly-Arg↓,以GGACTGCCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTC为上游引物序列,实线处为SacII的酶切位点,通过聚合酶链式反应合成重组人甲状旁腺激素基因;b.通过聚合酶链式反应合成的重组人甲状旁腺激素基因经SacII、XhoI双酶切后与经SacII、XhoI双酶切的表达质粒pET-35b(+)连接,将连接后的重组质粒转化E.coli DH5α宿主菌进行重组人甲状旁腺激素的表达;c.表达的重组人甲状旁腺激素以纤维素树脂(CBIND 200 Resin)亲和层析分离纯化。所述重组人甲状旁腺激素基因序列包含SacII、XhoI的酶切位点和编码Factor Xa识别位点Ile-Glu-Gly-Arg↓。所述表达的重组人甲状旁腺激素用Factor Xa、肠激酶来酶解制备单体,其中肠激酶的特征是能特异性能识别GACGACGATGACAAG编码的DDDDK-(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-)序列。一种重组人甲状旁腺激素的医药用途,主要用于治疗骨质疏松和甲状旁腺激素不足症。本专利技术采用pET35b(+)为载体,使重组人甲状旁腺激素(1-34)融合于纤维素结合结构域(CBDclos)的羧基端,并得到高效表达,且CBDclos-PTH融合蛋白主要以可溶形式存在,避免了复性步骤。又在序列中引入Factor Xa酶切位点,通过Factor Xa酶切和仅需经过两步CBIND 200 Resin亲和层析,就可得到纯度在80%以上的且N端不带有任何载体编码的氨基酸的rhPTH(1-34)粗品,大大简化了纯化工艺,提高PTH的产量同时又大大降低了工艺的成本。为该多肽的产业化的研究提供了极大的帮助和积累有效的数据。附图说明图1为rhPTH(1-34)/pET-35b(+)重组表达质粒构建示意图。图2为PCR扩增产物双酶切后克隆至pET-35b(+)(A)PCR扩增rhPTH(1-34)基因;(B)重组质粒双酶切鉴定图谱。其中,(A)是rhPTH(1-34)基因的PCR扩增图谱,1,DNA markers;2,PCR产物。(B)是重组质粒经SacII/XhoI双酶切图谱,1,酶切片断;2,PCR片段对照。图3为融合蛋白CBDclos-rhPTH(1-34)的表达与纯化图谱。其中,1,蛋白markers;2,非诱导的全菌蛋白;3,诱导的全菌蛋白;4,菌体超声上清;5,菌体超声沉淀;6,经CBIND 200 Resin亲和层析纯化的人甲状旁腺激素重组蛋白。图4为融合蛋白的酶解及rhPTH(1-34)的纯化图谱。其中,1,蛋白markers;2,对照;3,重组蛋白的酶切;4,纯化的rhPTH单体。图5为C4RP-HPLC纯化rhPTH(1-34)单体谱线。图6为rhPTH(1-34)样品的质谱检测谱线。具体实施例方式本专利技术选用了E.coli的偏爱密码子,以使目的蛋白高效表达,人工合成了rhPTH(1-34)基因,并且在rhPTH(1-34)基因的上游插入了ATTGAGGGTCGC序列,该序列编码的氨基酸Ile-Glu-Gly-Arg↓为Factor Xa的识别位点,因此可通过Factor Xa的酶解作用使rhPTH(1-34)从融本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种重组人甲状旁腺激素在大肠杆菌中的构建、表达与纯化方法,其特征在于:a.重组人甲状旁腺激素的构建:以下述基因序列为模板,CCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGG TAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAGAAACTGCAGGACGTACACAACTTCTAACTCGAG,实线处分别为SacⅡ、XhoⅠ的酶切位点,虚线处序列编码FactorXa识别位点I le-Glu-Gly-Arg↓,以GGACTGCCGCGGGTATTGAGGGTCGCTCCGTTTC为上游引物序列,实线处为SacⅡ的酶切位点,通过聚合酶链式反应合成重组人甲状旁腺激素基因;b.通过聚合酶链式反应合成的重组人甲状旁 腺激素基因经SacⅡ、XhoⅠ双酶切后与经SacⅡ、XhoⅠ双酶切的表达质粒pET-35b(+)连接,将连接后的重组质粒转化E.coliDH5α宿主菌进行重组人甲状旁腺激素的表达;c.表达的重组人甲状旁腺激素以纤维素树脂(CB↓ [IN]D200Resin)亲和层析分离纯化。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员:刘建宁孙自勇张菁陈均勇陈新园
申请(专利权)人:南京大学生物制药工程研究中心
类型:发明
国别省市:84[中国|南京]

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