本发明专利技术属于生物制药领域中应用基因工程技术生产蛋白质药物的范畴。本发明专利技术公开了一种新的具有快速溶栓效果的人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体蛋白Ｋ↓［２］ｔＰＡ的制备方法和应用。其制备方法是用基因工程技术构建了表达Ｋ↓［２］ｔＰＡ的重组质粒，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。将含有人组织型纤维酶原激活剂缺失变体（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）重组表达质粒的工程菌经１０Ｌ种子罐培养及１００Ｌ发酵，每１００Ｌ发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）纯品４ｇ，纯度达９５％以上，比活大于５０万ＩＵ／ｍｇ，内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主ＤＮＡ残留量等均达到临床使用标准，可用于心、脑血管疾病的血栓形成的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于治疗脑血管栓塞及心血管栓塞的蛋白药物的基因克隆、工程菌构建与鉴定及工业化制备与性质研究。
技术介绍
组织型纤溶酶原激活剂(tPA)分子由多个结构域组成(1)指形结构域(finger domain)对纤维蛋白有高度亲和性(2)表皮生长因子结构域(epidermal growth factor domain)可与肝细胞受体结合(3)环饼结构域1(kringle 1 domain)为受体结合区，(4)环饼结构域2(kringle 2 domain)为弱纤维蛋白结合区(5)蛋白酶活性结构域(protease domain)可特异性水解纤溶酶原(plasminogen)中Arg560-Val561之间的肽键，从而激活纤溶酶原生成纤溶酶(plasmin)。但tPA不容易作用于血栓内部的纤溶酶原，这就减缓了其溶栓速度，且它在体内的半衰期也较短，不易以静脉推注方式给药。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提出一种重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆、工程菌的构建与鉴定以及工业化生产的方法。本专利技术的技术解决方案一种重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆、工程菌的构建与鉴定以及工业化生产的方法，其特征在于a.从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因，将其接入TA克隆载体PCR2.1中，以该重组质粒DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)获得了重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)；b.将上述重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)与表达质粒pET29a通过基因重组的方法构建重组表达质粒pET29a/K2tPA，将重组后的表达质粒pET29a/K2tPA转化宿主菌BL21(DE3)，构建成表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体蛋白(K2tPA)的工程菌；c.将上述表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)的工程菌每隔3个月取出生产种子一支，进行质粒稳定性及表达稳定性鉴定；d.将重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)工程菌经种子罐培养及发酵罐工业化生产，经IPTG诱导表达后，其表达量用占菌体总蛋白的百分含量来表达。在重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)工程菌经10L种子罐培养及100L发酵罐工业化生产过程中，制备重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)包涵体，其方法为将已知重量的菌体，按10mL/g湿重比例加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl，2mmol/LEDTA，pH 7.0)搅拌混匀，用弗氏压碎器(French Pressure Cell)破碎细胞两次(16000～18000Lb/in2)，待细胞裂解液冷至4℃时用超声匀浆仪超声，直至溶液不再粘稠。4℃，20000r/min离心30min。。将前述的重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)包涵体复性，复性方法为取包涵体悬浮在9倍体积的洗涤缓冲液(100mmol/L Tris，2mmol/L EDTA，0.5％ Triton，2mol/L Urea，pH7.0)中，洗涤3次。取洗涤后的湿包涵体按10mL/g比例加入变性缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，6mmol/L盐酸胍，5mmol/L EDTA，100mmol/L巯基乙醇，pH8.0)，氮气饱和，37℃变性3h，4℃，8000r/min离心30min，取上清，按1/40比例逐步稀释到含有不同浓度的盐酸胍、NaCl、Urea、GSSG、GSH等的复性缓冲液中，4℃搅拌30min后，静置18h。测定K2tPA的酶活性及浓度。将前述所得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)蛋白的复性产物进行纯化，方法为复性产物用pH为5mol/L的盐酸调节至pH7.5，用0.45μm的滤膜过滤，经超滤浓缩后对5mmol/LTris-HCl溶液(pH 7.5)透析过夜，过滤后上TI-Sepharose亲和层析柱，依次用2倍柱床体积的平衡缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1mol/L NaCl，pH 7.5)、3倍床体积的洗涤缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl，pH 7.0)洗涤柱体，使OD280值洗至基线，用洗脱缓冲液(25mmol/L NaAc-HAc，1mmol/L EDTA，75mmol/L NaCl，pH 4.5)洗脱，收集K2tPA洗脱峰。将重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)工程菌经10L种子罐培养及100L发酵罐工业化生产，经IPTG诱导表达后，其表达量为占菌体总蛋白的20％。一种人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)蛋白的医药用途，其特征在于它可用于脑血管栓塞或心血管栓塞或脑血管栓塞及心血管栓塞中的任何一种可能。本专利技术中的K2tPA为tPA的缺失突变体，分子量为39.6kD，由355个氨基酸组成。K2tPA删除了tPA分子中的第4至175位氨基酸，包括Kringle1，Finger及EGF结构域，而保留了Kringle2及丝氨酸蛋白酶结构域。Finger结构域的缺失，使其丧失了对纤维蛋白高度结合的能力，但由于保留了Kringle2结构域，具有对纤维蛋白适中的亲和性，与tPA相比，K2tPA更容易作用于血栓内部的纤溶酶原，其结果是溶栓速度快于tPA。由于负责与肝细胞受体结合的Kringle1及EGF结构域的缺失，K2tPA在体内的半衰期较tPA大大延长，达18min，适于以静脉推注方式给药。目前临床上使用的tPA是用真核细胞培养制备的，而K2tPA结构上比tPA简单，易于复性，可利用基因工程方法在原核体系中表达制备。本专利技术解决了可供工业化生产的K2tPA工程菌的构建，建立了工业化生产K2tPA的工艺，同时成功地发展出高效、简便易行的复性及纯化方法，制备的K2tPA达到临床使用的各项标准，可用于治疗脑血管栓塞及心血管栓塞。附图说明图1为重组质粒pET29a/K2tPA的酶切鉴定图谱。其中，1为RT-PCR扩增产物；2、3为DNA分子量标志；4为重组质粒pET29a/K2tPA；5为重组质粒pET29a/K2tPA双酶切产物；图2为K2tPA基因的克隆及表达载体的构建示意图。图3为K2tPA在宿主菌BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE图谱。其中，1为非诱导宿主菌；2为经IPTG诱导后宿主菌；图4为K2tPA工程菌生长不同代次后质粒的酶切鉴定图谱。其中，1为DNA分子量标志；2为K2tPA工程菌生长不同代次后质粒的双酶切产物；图5为K2tPA工程菌生长不同代次后表达稳定性鉴定图谱。其中，1为非诱导工程菌；2-9为IPTG诱导后不同代次的K2tPA工程菌；图6为K2tPA工程菌100升发酵菌体生长曲线图。图7为K2tPA工程菌100L发酵菌体SDS-PAGE图谱。图8为K2tPA TI-Sepharose亲和层析图谱。图9为K2tPA SP-Sepharose离子交换层析图谱。图10为K2tPA包涵体及纯化后SDS-PAGE分析图谱。其中，A为K2tPA亲和层析产物；B为K2tPA凝胶过滤产物；图11为K2tPA反相HPLC分析曲线本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆、工程菌的构建与鉴定以及工业化生产的方法，其特征在于：ａ．从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因，将其接入ＴＡ克隆载体ＰＣＲ２．１中，以该重组质粒ＤＮＡ为模板，通过聚合酶 链式反应（ＰＣＲ）获得了重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）；ｂ．将上述重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）与表达质粒ｐＥＴ２９ａ通过基因重组的方法构建重组表达质粒ｐＥＴ２９ａ／Ｋ↓［２］ ｔＰＡ，将重组后的表达质粒ｐＥＴ２９ａ／Ｋ↓［２］ｔＰＡ转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３），构建成表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体蛋白（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）的工程菌；ｃ．将上述表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因（Ｋ↓［２］ｔＰ Ａ）的工程菌每隔３个月取出生产种子一支，进行质粒稳定性及表达稳定性鉴定；ｄ．将重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体（Ｋ↓［２］ｔＰＡ）工程菌经种子罐培养及发酵罐工业化生产，经ＩＰＴＧ诱导表达后，其表达量用占菌体总蛋白的百分含量来表达。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，陈于红，张菁，孙自勇，朱镇华，张巍，
申请(专利权)人：南京大学生物制药工程研究中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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