从尿液中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂（Ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｈ－ＵＴＩ）已经在临床中得到广泛地应用。本发明专利技术描述如何在甲醇酵母中构造可以分泌表达重组人尿胰蛋白酶抑制剂（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｒｈ－ＵＴＩ）融合蛋白的工程菌株，以及经过发酵、粗纯化、酶切、精纯化和一系列性质对比试验，最终确定了产量、纯度及药效学特征均合乎规模生产和临床应用要求的工程菌株以及ｒｈ－ＵＴＩ生产制造工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术描述了采用重组DNA技术在甲醇酵母(Pichia pastoris)中生产制备一种目前是从人尿液中提取的糖蛋白类药物------人尿胰蛋白酶抑制剂(Human urinarytrypsin inhibitor，h-UTI)，特别是该生产用甲醇酵母工程菌株的构造、发酵，表达产物的纯化、性质确证以及药效试验等。
技术介绍
1909年Bauer和Reich等就报道了人尿中存在一种胰蛋白酶抑制剂，也就是所谓的人尿胰蛋白酶抑制剂(Human urinary trypsin inhibitor，h-UTI)，但直到1977年Sumi等才成功地纯化出尿液中的这种糖蛋白分子。h-UTI是人血浆中的间-α-胰蛋白酶抑制剂(Inter-α-trypsin inhibitor，I-α-TI)降解产物。研究证实人血浆中的I-α-TI蛋白是由三条重链(H1、H2、H3，MW75～80kDa)蛋白分子和一条轻链蛋白Bikunin分子(MW 25kDa)经硫酸软骨素分子共价连接而成的丝氨酸蛋白酶抑制剂复合分子，它代谢转变后，其中连接有硫酸软骨素分子的Bikunin分泌到尿液之中，成为h-UTI。因此Bikunin也可以说就是h-UTI的前身，也有称h-UTI为尿抑素(Ulinastatin)。由于h-UTI分子内有N-糖基化和O-硫酸软骨素分子修饰，所以，自人尿中提取的h-UTI分子是一种高度糖基化修饰的蛋白，许多研究表明h-UTI的质谱分子量约为25～26kDa，而SDS-PAGE电泳显示分子量大约在35～45kDa之间，但是通过分子筛测得的分子量却与人血白蛋白相当，约67kDa左右(Kaczmarczyk，A.，Proteins of the Inter-α-inhibitorFamily---Biosynthesis，Plasma Clearance and Interaction with Extracellular MatrixComponents ISSN 0282-7476，Printed in Sweden by Nina Tryckeri，Uppsala 2003)。早在1985年，日本就将从人尿中提取的h-UTI用于临床实践，而国内1994年广州天普(Techpool)生化医药股份有限公司也将提取的h-UTI用于临床。h-UTI的主要适应症为急性胰腺炎，慢性胰腺炎的急性发作，急性循环衰竭，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。该提取成分临床疗效明确、副反应小、生产成本低，但是作为从尿中提取的一类药物，如何避免各种病毒污染和保证产品的质量稳定性也是一大技术难题。能采用基因重组的手段获得重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant HumanUrinary trypsin inhibitor，rh-UTI)是一项能将基础和应用研究有机结合的工作，但是，早年有报道称h-UTI糖蛋白分子中的硫酸软骨素分子是h-UTI发挥胰蛋白酶抑制剂作用的必要部分(Selloum，L.，etal.，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，36847～55，1987)，因此，在非哺乳动物细胞表达系统(如，E.coli，酵母)中产生的rh-UTI能不能形成正确的糖基化修饰是非常关键的。但是，德国的Bayer Aktiengesellschaft公司1995年申请的美国专利(US5407915，Human bikunin variants as proteinase inhibitors，and medicamentscontaining these)就很好地证明了糖基化并非是其活性所必须的，该专利中还描述了啤酒酵母表达的rh-UTI分子的N-端有严重的不均一性问题60％rh-UTI具有天然的N-端，而40％的N-端少一个丙氨酸(Ala)。之后，有许多研究都表明，E.coli重组表达的rh-UTI同样具对胰蛋白酶等酶抑制作用(Brinkmann，T.，etal J Biol Chem.，272(17)11171～11175，1997)，很明显，糖基化修饰在h-UTI分子中的作用需要重新审视。不过用现有的酵母或大肠杆菌生产rh-UTI的产量太低，加之蛋白的均一性不能保证，虽有一些研究报道，但是一直没有规模化生产和动物模型试验方面的研究报道，因此，有关rh-UTI的临床价值仍然十分难以确定。我们将人的h-UTI基因插入到专门的表达载体PICZa-DoI中，就成功地解决了酵母中表达h-UTI均一性以及表达产量不高等技术难题。在酵母中表达的rh-UTI的氨基酸序列(见SEQ-2)、糖基化位点以及二硫键连接次序如图1所示。有关表达载体PICZa-DoI的详细资料请参考本人2004年4月23日提交的题为“一种利用甲醇酵母系统高效表达tPA等外源蛋白的方法及其表达产物的纯化制备技术”(申请号200410017881.4)的专利。
技术实现思路
1.重组人尿胰蛋白酶抑制剂高表达工程菌株的获得在甲醇酵母(Pichia pastoris，Pichia methanolica)中我们了进行直接表达rh-UTI的实验研究，但是表达产量很低，所以将h-UTI基因导入我们申请过专利的融合型表达载体PICZa-DoI的多克隆位点KpnI和NotI之间，得到PICZa-DoI-UTI融合表达载体(见图2)。有关该融合型表达载体的详细情况请参见中国专利(申请号200410017881.4)。表达载体PICZa-DoI-UTI经测序确证序列正确无误后，按Invitrogen公司的操作手册中的方法进行转化、表达筛选就可以得到能表达DoI-UTI融合蛋白的菌株。为能获得高拷贝的转化子，采取了特殊的转化方式将PICZa-DoI-UTI中的DoI-UTI基因用XhoI-NotI双切出来亚克隆至载体pPIC9和载体pMETaA的XhoI-NotI之间，构造出融合表达载体pPIC9-DoI-UTI和pMETa-DoI-UTI。线性化pPIC9-DoI-UTI表达载体，转化筛选出GS115型高表达菌株，用线性化pMETa-DoI-UTI表达载体转化PMAD11型菌株，筛选出高表达的PMAD11型菌株。最后，再用线性化的PICZa-DoI-UTI表达载体电转化由筛选出的GS115型和PMAD11型高表达菌株制备的感受态，分别铺板在高Zeocin(≥500ug/ml)的YPD板筛选高抗性克隆，通过这种两级转化，就使最终的转化子的基因拷贝数不断增加，从理论上说，如此筛选出的工程菌种，GS115型和PMAD11型菌株比X33型菌株的拷贝数要高的多，最终我们根据表达产量的高低，筛选确定了三株GS115-UTI(GS115/pPIC9-pPICZa-DoI-UTI)、X33-UTI(X33/pPICZaDoI-UTI)和PMAD11-UTI(PMAD11/pMETa-pPICZa-DoI-UTI)三个菌株，它们是可以高效表达rh-UTI融合蛋白，具体实现过程见实施例1。2.重组人尿胰蛋白酶抑制剂的发酵、纯化过程研究构造的工程菌种按造Invitrogen的发酵操作手册中的程序，在30L发酵罐(Bioengi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由基因工程酵母菌株分泌的融合蛋白，通过纯化制备过程后得到具有医药用途的重组人尿胰蛋白酶抑制剂（ｒｈ－ＵＴＩ）分子，该分子具有生物学活性、特定的酵母糖基化修饰以及ＳＥＱ－２所描述的氨基酸序列组成等特征；。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄秀东，
申请(专利权)人：黄秀东，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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