分离的核酸，其编码ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４，或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了来源于发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)(W-14)tcd基因组片段的DNA序列，用于异种表达(heterologous expression)口服活性昆虫毒素。
技术介绍
如WO98/08932中所报道的，来自光杆状菌属(Photorhabdus)的蛋白质毒素已经显示出具有对抗昆虫的口服毒性。例如，通过发光光杆状菌(W-14)产生的毒素复合体已经显示含有十至十四个蛋白质，并已知这些通过来自四个不同基因组片段tca、tcb、tcc，和tcd基因的表达来生产。WO98/08932公开了许多天然毒素基因的核苷酸序列，包括此后作为tcdA1提及的毒素基因。从发光光杆状菌(W-14)分离的个别毒素中，命名为毒素A和毒素B的那些由于它们对抗所关心目标昆虫种类，例如玉米食虫的活性已经是焦点调查研究的主体。毒素A由两个不同的亚基组成。天然基因tcdA1(SEQ ID NO1)编码毒素原TcdA(参见SEQ ID NO1)。如通过质谱测定，是通过一个或多个蛋白酶处理TcdA1来提供毒素A。更准确地说，TcdA1是约282.9kDA的蛋白质(2516aa)，将其处理来提供TcdAii，通过SEQ ID NO1的核苷酸265-5811编码的约208.2kDA的蛋白质(1849aa)，和TcdAiii，通过SEQ ID NO1的核苷酸5812-7551编码的约63.5kDA的蛋白质(579aa)。WO01/11029公开了核苷酸序列，该序列编码TcdA1和TcbA并具有改变自天然基因的碱基组成使其更接近于植物基因。还公开了表达毒素A和毒素B的转基因植物。对于天然毒素的观察，毒素A的异种表达没有显示对昆虫的口服毒性水平。如果能发现可以提高异种表达毒素A毒性水平的方法那是非常有价值的。已经公开的美国专利申请2002/0078478披露了来自发光光杆状菌(W-14)tcd基因组片段的两个基因tcdB和tccC2的核苷酸序列，并公开了tcdB和tccC2与tcdA1在异种宿主中的共表达，导致了和tcdA1单独在这样的异种宿主中表达时获得的水平相比较提高的口服昆虫毒性水平。公开的美国专利申请2002/0078478中公开的tcdB基因在此后作为tcdB1提及。
技术实现思路
本专利技术提供来自发光光杆状菌W-14tcd基因组片段七个新发现基因tccC4、tcdA3、tcdA2、tcdB2、tccC3、tcdA4、tccC5的核苷酸序列。这些基因可以用于在异种宿主中表达口服活性的昆虫毒素。这些基因中的三个，即tccC3、tcdC4、tccC5，可以以tccC2所用的相同方式来使用，它们中的一个tcdB2，可以以tcdB1所用的相同方式来使用，如公开的美国专利申请2002/0078478中所披露的那样在此引入作为参考，当和tcdA1共表达时获得口服昆虫活性水平的提高。tcdA3、tcdA2和tcdA4基因和tcdA1相似，因此，期望它们能具有作为昆虫毒素基因的相似用途。本专利技术的一个实施方案中，tcdA1和tcdB1与选自tccC3、tccC4，或tccC5的基因在发光光杆状菌W-14以外的宿主例如植物中表达。本专利技术的第二个实施方案中，tcdA1和tcdB2与选自tccC2、tccC3、tccC4，或tccC5的基因在发光光杆状菌W-14以外的宿主例如植物中表达。附图说明图1说明了来自发光光杆状菌的毒素复合体d(tcd)岛的一部分。序列概述 SEQ ID NO1是来自发光光杆状菌W-14的tcdA1的DNA序列。SEQ ID NO2是来自发光光杆状菌W-14的TcdA1的氨基酸序列。SEQ ID NO3是来自发光光杆状菌W-14的tcdA2的DNA序列。SEQ ID NO4是来自发光光杆状菌W-14的TcdA2的氨基酸序列。SEQ ID NO5是来自发光光杆状菌W-14的tcdA3的DNA序列。SEQ ID NO6是来自发光光杆状菌W-14的TcdA3的氨基酸序列。SEQ ID NO7是来自发光光杆状菌W-14的tcdA4的DNA序列。SEQ ID NO8是来自发光光杆状菌W-14的TcdA4的氨基酸序列。SEQ ID NO9是来自发光光杆状菌W-14的tcdB2的DNA序列。SEQ ID NO10是来自发光光杆状菌W-14的TcdB2的氨基酸序列。SEQ ID NO11是来自发光光杆状菌W-14的tccC3的DNA序列。SEQ ID NO12是来自发光光杆状菌W-14的TccC3的氨基酸序列。SEQ ID NO13是来自发光光杆状菌W-14的tccC4的DNA序列。SEQ ID NO14是来自发光光杆状菌W-14的TccC4的氨基酸序列。SEQ ID NO15是来自发光光杆状菌W-14的tccC5的DNA序列。SEQ ID NO16是来自发光光杆状菌W-14的TccC5的氨基酸序列。专利技术详述为了分离只有光杆状菌才有的岛，我们测定了W-14菌株排列粘粒文库的末端序列，并使用BLAST算式和那些公众数据库中的末端序列像比较。将唯一的粘粒测序并检测致病性表型，如在昆虫中存留或杀死昆虫的能力。因为所有的光杆状菌菌株(甚至临床分离的)对昆虫是致病性的，我们通过基因同源性(BlastX)、基因组中的相对定位(tRNA衔接或E.coli内的类似核心序列)或改变的GC含量(W14核心计算为41.5％)来鉴定基因组岛。图1说明了来自发光光杆状菌W14(保藏号AY144119)的毒素复合体d(tcd)岛的一部分。该唯一的岛带有毒素复合体基因的多个拷贝。tc基因编码高分子量杀虫剂毒素复合体或破坏昆虫中肠的Tc’s。岛携带多个类似tcdA基因(ORFs36、37、45和50)和类似tcdB基因如基因(ORFs38和51)。片段还携带多个类似tccC基因(ORFs30、40、46和56)，类似ERIC(Enteric Repetitive Intergenic Consensus肠重复基因间共有区)序列(参见Versalovic，J.等，(1991)Distribution of repetitiveDNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes(重复DNA序列在真细菌中的分布并适于细菌基因组指纹法)Nucleic Acids Res 19(24)，6823-6831)，复制的ORFs(luxR类似调节基因)，和平端tcdA类似基因。根据本专利技术，优选的核酸包括至少一个以下的序列(a)根据SEQ ID NO3、5、7、9、11、13，和15的序列。(b)根据(a)定义序列的至少14个碱基对长的局部序列。(c)根据(a)定义序列杂交的序列。(d)根据(a)定义序列至少约70％、优选80％和更优选90％相同的序列，(e)根据(a)定义序列至少约70％、优选80％和更优选90％相似的序列，(f)根据(a)定义序列互补的序列，或(g)由于密码子简并的序列，如根据(a)定义序列通过(e)编码相同氨基酸序列(即，“同类编码”)。如在此所用的表述“杂交”指的是在以下特定条件下的杂交5×SSC；封闭剂(Roch本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：R·H·弗兰克康斯坦，N·R·瓦特菲尔德，
申请(专利权)人：巴斯大学，
类型：发明
国别省市：
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