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一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因及其制备方法技术

技术编号:1717983 阅读:243 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术属于食品工业生物技术领域,主要是利用分子生物学和基因工程技术,将来自茂原链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因克隆分离后,构建了含有该基因的重组原核表达载体pQE30xa-TGase,并在大肠杆菌JM109菌株中获得了表达,表达产物经过亲和层析分离纯化后,可以得到纯度为90%左右的重组谷氨酰胺转氨酶,重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml,高于原始菌株2-3倍。利用该酶进行酪蛋白改性和重叠虾的制作均取得良好效果。由于本发明专利技术利用大肠杆菌生产谷氨酰胺转氨酶,操作简单,产酶活性较高,生产成本低,表达的酶易于分离纯化,可为今后谷氨酰胺转氨酶的生产提供一条切实可行的途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品工业生物

技术介绍
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase.E.C.2.3.2.13),是一种催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键的酶,通过催化反应,可引起各种蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质与氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解,被誉为生物体内‘天然的粘合剂’,在化妆品、皮革制品、纺织品工业,尤其是在食品加工领域有着广泛的用途。目前已从多种生物材料(包括动植物及微生物)中获得了谷氨酰胺转胺酶,微生物来源的谷氨酰胺转胺酶,因其生产不受季节和原料限制,是谷氨酰胺转胺酶家族中最有可能进行大规模生产应用的一种,尽管有多种微生物自然状态下能产谷氨酰胺转胺酶,但大多数的产酶量不高;而通过常规诱变育种技术进行育种,耗时费力,又很难筛选到产谷氨酰胺转胺酶高产菌株,这就造成了实际生产成本较高,限制了该酶的大规模工业化生产。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是运用分子生物学技术和基因工程技术,将微生物谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌,然后通过诱导基因高效率表达谷氨酰胺转氨酶,从而提高该酶的产量和降低该酶的生产成本。本专利技术的技术方案为1.本专利技术首先提供一种获得微生物谷氨酰胺转氨酶基因克隆的方法提取链霉菌属茂原链霉菌基因组DNA后,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出谷氨酰胺转氨酶全长基因。2.提供一种生产谷氨酰胺转氨酶原核表达系统构建的方法主要是利用含6-His标签的原核表达载体pQE30-xa和大肠杆菌JM109进行谷氨酰胺转氨酶基因的融合表达。3.提供重组谷氨酰胺转氨酶分离纯化的方法,主要是利用Ni-NTA柱亲和层析的方法获得高纯度的谷氨酰胺转氨酶。本专利技术有益效果是重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml,高于原始菌株2-3倍,且利用大肠杆菌摇瓶发酵生产该酶的工艺流程少,原料简单且价格低廉。而在一些对酶纯度要求不高的行业,诸如皮革制品、纺织品工业、饲料加工等行业,也可直接使用未经纯化的粗酶,这将大大降低这些行业的生产成本。譬如若利用未经纯化的重组谷胺酰胺转胺酶对酪蛋白进行改性研究发现,粗酶也可很好的交联酪蛋白,使之溶液粘度增加,乳化能力提高,发泡性下降另外,通过重组的谷胺酰胺转胺酶粘和小体型虾,获得了体积增大且经煎煮后也不易分离的重叠虾,大辐度提高了小体型虾的商品价值。总之,通过这一方法生产的重组谷胺酰胺转胺酶同非重组谷胺酰胺转胺酶一样可以广泛应用于化妆品行业、食品加工业等领域中。四附图说明图1 谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增图2 用于生产重组谷氨酰胺转氨酶的表达载体pQE30xa-TGase图3 不同诱导培养时间下谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达A标准蛋白质分子量;B诱导培养12h;C诱导培养10h;D诱导培养8h;E诱导培养6h;F诱导培养4h;G诱导培养2h;H pQE30xa空白载体。图4 亲和层析纯化后的重组谷胺酰胺转胺酶五具体实施方式1.微生物谷氨酰胺转氨酶基因的分离克隆从茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)提取基因组DNA为模板,具体DNA提取方法参照Promega说明书,根据相关谷氨酰胺转氨酶基因序列合成引物,用上下游引物TGP1(5’CGGGATCCATG CGC ATA CGC CGG AGA 3’),TGP2(5’CG AAGCTT GCC AGC CCT GCT TTA CCTTG 3’)并在其5’端分别加入BamHI和HindIII酶切位点和相应的保护碱基,进行谷氨酰胺转氨酶基因全长的扩增,PCR扩增条件95℃预变性5min,94℃1min,55℃45s,72℃90s,35个循环,最后72℃延伸7min。制备1.2%TBE琼脂糖凝胶,取PCR扩增产物5uL与6×凝胶电泳上样缓冲液1uL混匀后电泳,电压5V/cm,电泳完毕后,在凝胶成像分析系统中观察结果并拍照,结果见附图1。利用DNA凝胶纯化试剂盒纯化回收1.2Kb的PCR产物,与克隆pUC-mT载体(上海博亚生物科技有限公司)进行连接。10ul连接反应体系为pUC-mT载体50ng,PCR产物50ng,1x连接缓冲液2μl,T4DNA连接酶3weiss,4℃连接过夜。连接产物转化感受态JM109细胞,并在在含有x-gal、IPTG及Amp的LB平板上进行重组子的筛选。挑选白色菌落,抽提质粒DNA后,一部分进行酶切和PCR鉴定,将重组质粒命名为pUC-mT-TGase;另外一部分送博亚公司进行目的片段序列的双向测定,测序最终结果如下序列atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560 cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因,长度1246,其特征是:1-180位的核苷酸为编码谷氨酰胺转氨酶基因前导肽的序列,该段序列与酶的跨膜运输和正确折叠有密切关系;420-422位的核苷酸为编码酶活性中心cys的序列;谷氨酰胺转氨酶全长基因序列为:atgcgcatacgccggagagctctcgtcttcgccactatga40gtgcggtgttatgcaccgccggattcatgccgtcggccag80gcgagg ccgccgccgacaatggcgcggggg aaagagacga120agtcctacgccgaaacctaccgcctcacggcggatgacgt160cgcgaacatcaac gcgctcaacgaaagcgctccggccgct200tcgagcgccggcccgtcgttccgggcccccgactccgacg240acagggtcacccctcccgccg agccgctcgacaggatgcc280cgacccgtaccgtccctcgtacggcagggccgagacggtc320gtcaacaactacatacgcaagtggcagcag   gtctacagcc360accgcgacggcaggaagcagcagatgaccgaggagcagcg400ggagtggctgtcctacggctgcgtcggtgtcacctgggt c440aattcgggtcagtacccgacgaacagactggccttcgcgt480ccttcgacgaggacaggttcaagaacgagctgaagaacgg520 caggccccggtccggcgagacgcgggcggagttcgagggc560cgcgtcgcgaaggagagcttcgacgaggagaagggcttcc600agcgggcgcg tgaggtggcgtccgtcatgaacagggccct640ggagaacgcccacgacgagagcgcttacct...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:田兴军张智俊李亚玲
申请(专利权)人:南京大学
类型:发明
国别省市:84[中国|南京]

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