治疗中的逆转录转座子抑制制造技术

ＲＮＡ干扰用于癌损伤治疗中，其中ＲＮＡ识别至少一个ＬＩＮＥ－Ｉ重复元件的一部分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】治疗中的逆转录转座子抑制
本申请涉及逆转录酶表达抑制剂在治疗中的用途。技术背景Spadafora在其论文(Cytogenet Genome Res 105: 346 350(2004))中讨论内源的、非端粒逆转录酶及其在胚胎发生和转化中的意义。更特别地，逆转录酶(RT)由两类重复基因组元件编码，即逆转 录转座子和内源逆转录病毒。它们都需要RT作为其系统的基本组成。可逆转录转座子元件(retrotransposable elements),如长散布元件 (LINEs)，长期以来认为是"垃圾DNA"，除了作为不再需要的剩余 DNA以外只有很少的用途，并没有将其基因组中删除。早在1971年 (Temin， J Natl Cancer Inst 46: 56 60)，这一部分已经受到挑战，但 是，本领域继续简单地将这种序列认为是"垃圾DNA"。Spadafora在其论文(同上)中回顾了该技术，并证明了 RT编码 基因的表达通常在非病理、末期分化的细胞中被抑制，但是，在非常 早期的胚胎、生殖细胞、胚胎和肿瘤组织中是活性的，所有这些都具 有高的增殖潜能。在鼠科胚胎中阻断RT停滞了其发育，并且去除阻断 影响都没有重新启动胚胎发生。在癌细胞中，增殖得到显著减少，在 48和72小时之间观察到区别。Kuo等人(Biochem and Biophys Res Com 253: 566 570 (1998)) 从人类小细胞肺癌的cDNA文库中确定出一个1.7kb的LINE-I (LI) 转录本。他们发现，这种重复元件在人类组织中无处不在地表达，包 括正常的(纤维原细胞和肝脏)和转化的。此外，他们表明衍生自此 转录本的正义寡核苷酸，与人类肝细胞瘤细胞孵育，降低了细胞增殖 的速率。该元件在正常和癌组织中的存在显示出这种重复元件与细胞 增殖的常规功能有关。作者将细胞增殖的降低解释为由于突变而对参 与控制细胞生长的基因的沉默或功能性变更。作者并不认为这种转化是可逆事件。相反，我们现在确定，逆转录转座子的LINE-1族的抑制对于抑制 或阻碍癌组织的增殖及剌激其分化是有效的。
技术实现思路
因此，本专利技术第一方面是提供RNA干扰抑制癌组织非特异性增殖 的用途，其中RNA识别至少一个LINE-1重复元件的一部分。另一方面，本专利技术提供RNA干扰(RNAi)在治疗癌损伤中的用 途，其中RNA识别至少 一个LINE-1重复元件的一部分。使用本专利技术RNAi的RT表达减少导致癌组织增殖的降低，常常大 于50%，且至少在受治疗的细胞中随后的增殖主要为分化生长。因此， 本专利技术的RNAi起到减少癌组织增殖，同时激励分化的作用。应当理解，本专利技术的RNAi特别指LINE-l，其用途避免使用一般 的非核苷酸RT抑制剂(NNRTI)，其封闭所有的RTs。事实上，令人 惊讶的是，本专利技术的RNAi，直接抗(against) LINE-1 ，起封闭或抑制 癌组织增殖的作用，假定LINE-1只是RT编码元件下的亚群。目前，LINE-1家族中只有少数成员(大约6 8个)被识别为具 有特别高的活性，本专利技术给出抗这些中任一个的RNAi。使用RNAi的 联合治疗，其中设计每个rna对于单个line-1逆转录转座子 (retrotransposon)来说都是特定的，但是优选使用抗共有序列的RNA。 这种共有序列可以用于两个或多个LINE-1家族成员，但是优选用于活 性成员，如果多个都是同一的(identified)，则可以用于多个。优选地，RNAi为短千扰RNA (siRNA)或双链RNA (dsRNA)。还优选，RNA为短发夹RNA，优选适于且优选通过siRNA表达 载体方法来给药。合适的载体包括本领域公知并在此仍要讨论的逆转 录酶病毒质粒。通常优选，本专利技术中使用的RNA具有10或更大的片段，如15、 20、 30、 40或更多核苷酸，其相当于转录LINE-1 DNA区域的正链意 义(direct sense)。然而，特别优选为21个核苷酸。转录的LINE-1 DNA 优选选自共有区域。然而，并不必须要求核苷酸的片段与转录LINE-1 DNA的所选区域完全一致，只要本专利技术的干扰RNA起到结合来自LINE-1 DNA的转录RNA即可。然而，特别优选的是，来自RNAi的RNA核苷酸片段与相应来自 LINE-1序列的转录DNA片段一致。RNAi优选包括与相应来自LINE-1 序列的转录DNA片段一致的21个核苷酸序列，更优选由相应来自 LINE-1序列的转录DNA片段一致的21个核苷酸序列组成。本专利技术的RNAi可以形成环形结构，其中，环可以位于上述核苷 酸片段范围内，在这种情况下，片段可以被环中断。该环可以采取 dsRNA形式作为其结构的一部分，可以在RNA片段中提供1、 2或3 个核苷酸缺口。通常优选，没有导致RNA片段省略的环，使得目标 mRNA沿着选定序列结合。本专利技术的RNAi可以简单地为能够连接来自LINE-1元件的对应转 录序列的短序列，或可以另外包括一个或两个末端序列和/或内部环序 列。应当理解，选自LINE-1内的序列应当是开放阅读框架，例如可以 选自RT的ORFl和ORF2。因此，优选开放阅读框架编码逆转录酶。这包括具有逆转录活性的任何蛋白质。RNAi治疗可以以任何方便的方式给药。通常，重要的是必须确保 RNAi到达目标细胞。虽然本专利技术的RNAi可以以任何合适的载体直接注射到目标位置， 但是其还可以绑定至例如组织工程细胞支架(scaffolds)或纳米颗粒 (nanoparticles)而给药。更优选地，RNAi可以例如作为质粒或通过逆转录酶病毒来给药。 腺病毒和腺相关病毒的载体可以得到使用以来分配RNAi的编码序列， 优选以质粒形式。其他类似的病毒和逆转录酶病毒以及其他这种载体 也可以使用。特别地，己经确定，将编码序列如质粒传递至目标位置 的功效可以在循环中增加，如果使用渗透因子，如血管内皮生长因子 (VEGF) c传递的其他合适方法为 pSUPER RNAi系统kit (www.oligogengine.com)。附图说明图l:通过抗RT药物的增殖抑制作用。(A) 用DMSO (对照)、奈韦拉平(nevirapine) (NEV)和依 法韦仑(efavirenz) (EFV)处理培养基中生长的细胞。每96小时对 细胞计数并重新装盘，进行5个周期。然后，在没有抑制剂的培养基 中培养细胞(2个周期)。然后，再将RT抑制剂加入进行2个周期。 细胞计数用对照数的％来表示，其确定为100%。数值代表了三个实验 的合并数据。(B) RT抑制剂存在的4个96小时周期和去除药物后的细胞周期图。图2: RT抑制剂导致黑素瘤细胞的形态分化。(A) 在DMSO- (a、 b、 c)、奈韦拉平-(d、 e、 f)或依法韦仑-(g、 h、 i)处理培养的A-375细胞系。在姬姆萨(Wright Giemsa)染色后(左栏)、SEM (中栏)和oc微管蛋白(绿色)与细胞核PI着色 (红色)之后的共焦显微镜(右栏)后的相差显微镜观察的培养物。(B) 黑素瘤衍生的TVM-A12原代细胞。DMSO- (a、 b、 c)和 奈韦拉平处理(d、 e、 f)的细胞在相差显微镜(左本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＲＮＡ干扰以抑制癌组织非特异性增殖的用途，其中，该ＲＮＡ识别至少一个ＬＩＮＥ－１（Ｌ１）重复元件的一部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：E加拉奇，P西尼巴尔迪，C斯帕达福拉，C皮托吉，I夏曼纳，C梅亚雷列，
申请(专利权)人：高等健康研究院，E加拉奇，P西尼巴尔迪，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]