本发明专利技术公开了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及其应用，所述抗原表位序列如SEQ ID NO.1所示，定位在105‑109AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK‑15细胞发生反应。所述抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。
Preparation and application of antigenic epitopes and antibodies of a E2 protein of swine fever virus
The present invention discloses a kind of classical swine fever virus E2 protein epitopes, preparation and application of antibody, the antigen epitope sequences such as SEQ ID NO.1 shows, located at 105 109AA. The epitope can react with CSFV, and do not react with PK 15 cells. The antigen epitopes using the CSFV antibody drug detection reagent, the application of the classical swine fever virus antibody in the diagnosis of antigen can be used by ordinary chemical synthesis preparation method, compared with gene engineering expression protein as diagnostic antigen, antigen synthesis process is simple, high purity.
【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用
本专利技术属于生物
更具体涉及一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用。
技术介绍
CSF是由CSFV引起的猪的一种高度接触性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员之一。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约12.3kb，仅含有一个大的开放性阅读框架(ORF)。此ORF翻译成含3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工成结构蛋白和非结构蛋白，其结构蛋白和非结构蛋白在病毒RNA上的编码顺序为Npro、C、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中，除C、Erns、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。E2为CSFV的另一囊膜糖蛋白，又称为gp55，是病毒主要的抗原蛋白，也是三个病毒糖蛋白中保守性最低、最易变异的分子。E2常以100kDa的同源二聚体及与E1形成75kDa的异源二聚体形式存在于病毒粒子及CSFV感染的细胞表面。E2可诱导产生CSFV的中和抗体，免疫猪可诱导产生对致死量CSFV的保护性免疫。E2的蛋白骨架由370个氨基酸(ORF编码的657-1062氨基酸残基)组成，并以其C端的40个疏水氨基酸锚定在膜上。由于糖基化程度不同，E2的分子量可为51-58kDa。E2的抗原决定区在其N端部分(ORF编码的第690-866氨基酸)，可分为2个独立的抗原结构单元，四个抗原结构域A、B、C、D。在病毒感染过程中，细胞膜上的受体与病毒配体结合是介导病毒侵入宿主细胞的关键因素，也是病毒能否感染细胞的关键。因此，研究病毒受体和病毒配体之间的相互作用成为目前病毒致病机制研究的热点问题之一，因为以其中的任何一个为药物靶点都可以阻断病毒与靶细胞的结合，从而抑制病毒的感染。关于CSFV配体的研究，已证实Erns蛋白参与了病毒的早期吸附，E1和E2蛋白形成的异源二聚体可以介导CSFV侵入宿主细胞，并且此异源二聚体还起到使哺乳动物细胞融合的作用。但是，究竟这三种蛋白的哪些氨基酸序列作为病毒配体与病毒受体结合，目前还没有详细的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位，所述抗原表位为：编码E2-6D11抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.1：PFDTS所示，定位在105-109AA。所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK-15细胞发生反应。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在猪瘟病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得猪瘟病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位模拟肽的制备方法，该方法优点是利用噬菌体随机肽库来筛选猪瘟E2单克隆抗体E2-6D11识别的表位，可以筛选出与原始序列不同但功能相似的构象表位抗原，即模拟表位抗原。为了实现上述的目的，本专利技术通过以下技术措施实现.一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位的制备方法，其步骤是：A、利用分子生物学对E2主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建。B、将重组蛋白的诱导表达与纯化，C、利用纯化蛋白进行小鼠免疫，获得杂交瘤细胞和单克隆抗体。D、单克隆抗体的稳定性和特异性检测。E、获得上述特异性单克隆抗体的抗原表位，并对其进行鉴定。一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在制备治疗或预防猪瘟病毒ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：1、以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原。2、以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板。3、按常规方法制备试剂盒其他组分。4、使用试剂盒检测血清中狂犬病病毒抗体。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、本专利技术的抗原表位是由针对猪瘟病毒石门株的特定单抗筛选而来，具有极高的特异性和稳定性。2、与现有的灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，生产过程中不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。3、利用获得的抗原表位合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。4、本专利技术适合大规模的临床血清检测，反应时间短，2小时即可出结果。5、本专利技术试剂盒与其他病毒阳性血清无交叉反应，敏感性高，特异性好。6、本专利技术试剂盒操作简便，与猪瘟病毒正向间接血凝试剂盒符合率高。附图说明图1为E2重组蛋白的表达与纯化，M：蛋白质分子量标准；1：IPTG诱导的pCold-E2转化菌裂解物沉淀；2：IPTG诱导的pCold-E2转化菌裂解物上清；3：IPTG诱导的纯化的pCold-E2蛋白；4：IPTG诱导的pCold-TF转化菌。图2为IFA鉴定E2蛋白单克隆抗体的特异性。图3为E2蛋白单抗的Westernblot鉴定，1：CSFV感染的PK-15细胞；2：未感染的PK-15细胞；3：Marker。图4为E2-6D11株单克隆抗体表位的鉴定结果，其中，(A)E2-6D11鉴定表位第1轮；(B)E2-6D11鉴定表位第2轮(C)E2-6D11鉴定表位第3轮具体实施方式实施例1：材料与方法毒株、细胞和实验动物猪瘟病毒石门株、SP2/0骨髓瘤细胞、PK-15和Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。细胞均在37℃、5％CO2和10％FBS(FBS，Gibico，Shanghai，China)条件下培养。BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。载体、试剂和菌株pCold-TF载体，大肠杆菌BL21(DE3)购自Takara(上海)公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购于Sigma(上海)公司；核酸内切酶EcoRI购自NEB(上海)公司。实施例2：E2主要抗原表位的扩增、蛋白制备E2主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建根据NCBI发表的CSFVE2基因序列，将E2基因的第1-537位核苷酸序列送公司(金唯智)优化合成，并将合成的E2基因与pCold-TF载体连接构建质粒，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-E2。重组蛋白的诱导表达与纯化将重组质粒pCold-E2转化到BL21(DE3)大肠杆菌中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，16℃振荡24小时。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5×SDSbuffer煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照。之后将pCold-E2转化表达菌按1∶1000比例接种到4mL含100μg/mLAmp的LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h。然后再按1∶100将复苏的菌液接种于100mL含100μg/mLAmp的LB培养液中，37℃、200r/min培养，至OD600达到0.6～0.8时停止，加入终浓度为1mmol/LIPTG，16℃诱导24h后，离心收集菌体。表达后的菌体进行超声破碎，差速离心后收集上清蛋白。采用Ni柱(Biotool)进行纯化，纯化的蛋白分装后保存于-80℃。pCold-E2载体转化的表达菌E.coliBL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK‑15细胞发生反应。
【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以与CSFV反应，而不与PK-15细胞发生反应。2.如权利要求1所述的一种猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位，所述抗原表位如SEQIDNO.1：PFDTS所示，定位在105-109AA。3.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位的抗体，所述抗体是多克隆或单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的治疗或预防猪瘟病毒。5.一种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要求1或2中所述的抗原表位给药至动物宿主以在所述动物...
【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，李国新，武吉强，徐晶晶，姜一峰，高飞，童武，郑浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31
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