本发明专利技术涉及家猪增殖诱导配体ｃＤＮＡ及其克隆、表达技术。家猪增殖诱导配体的基因，具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２所示的序列。其克隆方法如下：根据家猪增殖诱导配体的保守序列设计引物；提取总ＲＮＡ；通过ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增出一段ｃＤＮＡ，命名为Ｐ１，克隆入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，测序；再根据Ｐ１的序列设计正义引物及反义引物分别用以扩增出上述ｃＤＮＡ３’－及５’－全长末端区域，扩增片段分别命名为Ｐ２及Ｐ３，分别克隆入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，并测序；将Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３拼接出ｃＤＮＡ全长序列，并设计首尾引物一步扩增出全长ｃＤＮＡ序列，克隆入ｐＭＤ１８－Ｔ载体，挑取阳性克隆进行测序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及家猪增殖诱导配体cDNA及其克隆、表达技术。
技术介绍
人增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand, APRIL)为1998年首先发现 并成功克隆的与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员，主要表达 于树突状细胞、巨噬细胞和T、 B淋巴细胞表面。APRIL可通过特异性受体促进部分恶性 胶质瘤细胞的增殖，体外可促进T、 B细胞的增殖和T细胞的活化，体内影响胸腺非依赖 性B细胞的免疫反应。APRIL转基因小鼠的T细胞在体外活化后能明显增强其增殖能力。 APRIL诱导的增殖效应还可经TACI调节，TACI在活化T细胞表面表达增加，用TACI-Ig 能有效抑制APRIL促活化T细胞的增殖作用，但对未活化的T细胞无此效应。APRIL缺陷 小鼠存在选择性IgA缺失，降低血清IgA抗体对TD抗原相关性黏膜免疫的应答反应，APRIL 对T细胞非依赖性II型抗原反应有明显的增强作用。由于APRIL在免疫系统中的重要调节 作用，其与免疫系统疾病关系密切，在临床方面能通过对APRIL的检测而达到早期诊断， 这对肿瘤的早期治疗具有重要意义，通过可溶性受体竞争性抑制配体与膜受体结合来抑制 某些肿瘤细胞的增殖，为肿瘤治疗提供新的靶点。因此，通过APRIL抑制剂的筛选可为与 APRIL高表达相关的多种疾病的治疗提供新的候选药物。可见对APRIL功能及机理的进一 步研究将为疾病的诊断、预防和治疗提出新的思路和方案。根据GenBank、 EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前只有 人、鼠和兔的APRIL cDNA已被克隆，并分别己在GenBank数据库中申请了序列号，序列 号分别是AF046888、 NM023517和EF494239。家猪增殖诱导配体(pAPRIL) cDNA还未被克 隆出来，关于pAPRIL基因的研究及应用在整个国内外还处于完全空白状态。家猪是国内 外十分重要的肉源畜类，由于增殖诱导配体具有很强的免疫调节能力，基因工程家猪 APRIL蛋白有可能开发成一种能增强家猪免疫能力的生物制剂(如免疫佐剂等)，用于体 质弱、免疫功能低下的病家猪，增加家猪的抗病毒能力，尤其是在由于家猪新型免疫抑制 性疾病如家猪蓝耳病、伪狂犬，圆环病毒病(仔家猪断奶多系统消耗性综合症)，导致传 统兽医疫苗免疫效力不足或失效，因而给畜牧业生产造成了极大损失的今天。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量家猪的细胞因子得以克隆及 重组表达，许多细胞因子基因工程药物面市。细胞因子用于细菌病毒类疾病的治疗能够 克服传统药物副作用大、疗效不佳的缺点，而且运用基因工程方法生产的细胞因子，可以 大大降低生产成本，获得良好的市场信价比，因此，重组家猪APRIL蛋白具有潜在的巨大 市场应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种从家猪提取的增殖诱导配体(APRIL) cDNA，并提供增殖诱导配体cDNA的克隆方法、重组表达及活性检测技术。本专利技术从家猪中克隆到增殖诱导配体cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。家猪增殖诱导配体，它具有SEQ ID N0.2所示的序列。本专利技术的家猪增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下(1) 根据己知物种的增殖诱导配体cDNA保守序列设计引物正义寡核苷酸兼并引物zl: 5， — CAGAG跳NGATGNCCTGGAAGCCTG -3， (N=A、 T、 G、 C)反义寡核苷酸兼并引物z2: 5， _ TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG-3， (N=A、 T、 G、 C)(2) 从家猪脾脏提取总RNA，(3) 通过RT-PCR方法，以上述引物zl及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列， 命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定，(4) 应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，根据已获得的P1核苷酸序列设计正义引物 GSP2(5， -GTCTCCTGCCTTCCCTGGCCCTCCCGAG-3，)及反义引物GSP1 (5， -CAAGCGTGGGAGAGG TCTGGAGGCCCAAG-3，)分别用以扩增出APRIL cDNA 3，-及5，-全长末端区域，扩增片段 分别命名为P2及P3，然后分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定，(5) 根据Pl、P2、P3的重叠区域拼接出cDNA的全长序歹iJ，并设计首尾引物FL1(5' -GCTTCCTAGAGAAACTGACACTAAATTCTC-3，)及FL2 (5， -CTGTCAAACCTGGGGTTCCAGTCAAAC- 3，)一步扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD18-T载体，挑取阳性克隆进行碱基序列测定及验证。 上述家猪增殖诱导配体cDNA的克隆方法具体操作如下(1) 根据已知物种的增殖诱导配体全长cDNA两段高保守区域设计同源克隆的正义寡 核苷酸兼并引物zl (5， - CAGAGNNCNGATGNCCTGGAAGCCTG -3， (N=A、 T、 G、 C))与反义 寡核苷酸兼并引物z2 (5， - TCACAAACCCCAGGAANGTTCCATG -3，(N=A、 T、 G、 C))，(2) 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)，按照操作手册，提取出家猪脾 脏细胞的总RNA。(3) 应用RT-PCR方法，以上述zl及z2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全 长为490bp，命名为P1，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反 应条件为以总RNA为模板，在50ul反应体系中，加入5XRT-PCR反应缓冲液10u 1、 25mM MgS042 u 1、 lOmM dNTP混合物1 u 1、 20 y M的上下游引物各2. 5 u 1、 AMV逆转录酶(Takara公司)1 y 1、 Tf 1 DNA聚合酶1 u 1及RNA模板2 P 1，补水至50 u 1。 RT-PCR 循环参数为48。C逆转录45min， 94。C变性2min，再进行40个PCR循环(94。C变性30s， 57。C退火lmin， 68。C延伸2 min)，最后于68'C延伸7 min。 RT-PCR产物用1. 5%的琼月旨 糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约bp的DNA条带，置4'C保存。(4) 应用cDNA末端快速扩增(RACE)方法，采用SMART RACE Kit (Clontech公司) 根据已获得的Pl碱基序列设计正义引物GSP2 (5' - GTCTCCTGCCTTCCCTGGCCCTCCCGAG -3')及反义引物GSP1 (5， - CAAGCGTGGGAGAGGTCTGGAGGCCCAAG -3，)分别用以扩增出 APRILcDNA3，-及5，-全长末端区域，扩增片段分别命名为P2 (575bp)及P3 (820bp)， 分别克隆入pMD18-T载体，对其碱基序列进行测定。(5) 根据Pl、 P2、 P3的重叠区域拼接出全长序列，并设计首尾引物FL1 (5'-GCTTCCTAGAGAAACTGACACTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
家猪增殖诱导配体ｃＤＮＡ，其特征在于，它具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张双全，水燕，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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