一种环形接头及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于Ion Torrent二代测序平台的环形接头包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签和Ion接头A的部分序列和互补序列区域；互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。本发明专利技术的环形接头相对于普通接头更稳定能够实现高效、高灵敏度与低成本的二代文库构建，实验操作简单。

A circular joint and its application

The invention relates to a ring joint Ion Torrent two generation sequencing platform from the 5 'end and 3' end arranged on any base sequence region, barcode region, the positive and negative sample chain tags and Ion connector A partial sequences and complementary regions based on complementary sequence regions including sequence; folded and Ion joint part A and with the samples of barcode sequences are complementary. The annular joint of the invention is more stable than the common joint, and can realize the construction of two generation library with high efficiency, high sensitivity and low cost, and the experiment is simple.

【技术实现步骤摘要】
一种环形接头及其应用
本专利技术涉及一种基于IonTorrent二代测序平台的环形接头，以及该环形接头的应用，属于生物

技术介绍
目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的快速发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。二代测序技术靶向测序同样具有巨大优势，由于测序的区域小，可以对某些区域进行深度测序，使得低频突变的检测率大大提高。肿瘤关键基因较多，适合使用二代测序对某些关键的基因进行深度测序，得到肿瘤致病突变信息及相关用药靶点信息。虽然高通量测序在肿瘤诊断方面应用前景广阔，但当下仍存在技术上的不足限制了其更为深入的应用，如：针对cfDNA的检测，其检测灵敏度有必要进一步提高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能够更稳定地实现高效、高灵敏度与低成本的二代文库构建，实验操作简单的环形接头，以及该环形接头的应用。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种环形接头，包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。上述Ion接头A部分和互补序列区域通过自身折叠互补的序列相间隔，所述互补序列区域中与Ion接头A部分互补的序列和与样本barcode互补的序列通过与正负链标签相同的序列相间隔。上述任意碱基区域是12个随机碱基。上述正负链标签为1个碱基。上述样本barcode区域的碱基个数为8个。上述Ion接头A部分的碱基个数为15个。上述环形接头还包括设置在5’端的磷酸化修饰和公共序列，所述公共序列的碱基个数为13～16个。上述环形接头的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：上述环形接头用于IonTorrent二代测序平台中文库构建的应用。本专利技术具有积极的效果：(1)本专利技术的环形接头基于IonTorrent二代测序平台，具有灵敏度高，特异性强，与样本DNA连接效率高，可以提高低频突变的灵敏度等特点，最低可以检测出样本DNA中0.01％的突变，满足了对cfDNA中极少量突变ctDNA检出的要求。(2)本专利技术的环形接头是独特的闭环接头，包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的互补序列区域，相对于普通接头更稳定，连接效率更高。任意碱基区域有12个随机碱基，理论上能够产生412种分子标签序列，以确保将每个源分子带上独一无二的分子标签，从而使建库和测序过程中引入的错误降到最低，提高检测突变的灵敏度。正负链标签为1个固定的碱基，相较于现有的多碱基随机正负链标签，有效的节约了测序读长并简化了对链标签的分析。样本barcode碱基序列为8个，能够识别不同样本的片段化产物。(3)本专利技术的环形接头中包括单碱基链标签，可以根据该碱基区分DNA双链正义链和反义链，更进一步提高了其灵敏度。(4)本专利技术的环形接头中5’端磷酸化有利于文库构建中与接头序列结合。附图说明图1是本专利技术实施例的环形接头的溶解曲线图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本专利技术中。主要试剂：所有试剂购买自正规厂家，接头反应试剂包括：Klenow片段(3’→5’exo-，北京NEB，货号：M0212V)、dTTP(上海博彩生物科技有限公司，货号：C2104)VAhtstmNanoDNAlibraryprepKit(南京诺唯赞生物科技有限公司EndPrepMix，货号：602-02)；文库构建试剂包括：VAhtstmNanoDNAlibraryprepKit(诺唯赞包括dA-TailingMix、LigationMix、AmplificationMix2，货号：602-02)、TakaraTaqHS试剂(大连宝生物，货号：AC1401A)。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与IonTorrent二代测序平台相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion316chip等部分。本方法实验前需要新鲜配制的试剂：75％乙醇(100％乙醇与无核酸酶水按3:1比例配制)。主要仪器：PCR仪(厂家：EXcellBio)、IonTorrentPGM测序仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪等。实施例1、接头制作。本实施例的环形接头的核苷酸序列如下：5’-pAGATCGAGAGCGTCNNNNNNNNNNNNATCGAATCACTGCTGAGTCGGAGACACTGCGTGTCTCCGACTCAGGAGTGATTCGAT-3’(SEQIDNo.1)。其中，N代表任何一个碱基序列；5’端的p表示磷酸化修饰，能够在文库构建过程接头反应中与样本DNA3’端形成磷酸二酯键。从5’端至3’端依次是：公共序列为AGATCGAGAGCGTC，样本barcode区域序列为ATCGAATCACT，正负链标签序列为G，Ion接头A部分序列为CTGAGTCGGAGACACTGC，自身折叠互补的相间隔序列为CTG，折叠后与Ion接头A部分互补序列为GTGTCTCCGACTCAG，与正负链标签相同的相间隔序列为G,折叠后与样本barcode互补序列为AGTGATTCGAT。本实施例中的引物对的设计和制备采用现有的常规方法。接头序列选择综合评价，设计效率和实验结果最好的接头序列。1.1、接头退火延伸反应。将合成的环形接头采用1*TE按照说明书溶解，稀释成浓度为100μM的工作液。取30μl的工作液，加入3.3μl的10*PCR反应buffer中，加热到95℃，缓慢冷却到室温，制作好接头，将退火后的产物各取1μl用Sybgreen的方法进行质控反应。体积为10μl的质控反应体系配比如下：5μl的SYBRGreenMix本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环形接头，其特征在于：包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A的部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。

【技术特征摘要】
1.一种环形接头，其特征在于：包括从5’端至3’端依次设置的任意碱基序列区域、样本barcode区域、正负链标签、Ion接头A的部分和互补序列区域的序列；所述互补序列区域包括折叠后与Ion接头A部分和与样本barcode的序列分别互补的序列。2.根据权利要求1所述的环形接头，其特征在于：所述互补序列区域中与Ion接头A部分互补的序列和与样本barcode互补的序列通过与正负链标签相同的序列相间隔。3.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于：所述任意碱基区域是12个随机碱基。4.根据权利要求2所述的环形接头，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵新泰，王明，潘文健，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31