一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用，该方法包括以下步骤(1)将双链DNA片段或RNA/DNA杂合体片段变性，使其成为单链DNA；(2)在单链DNA的3′端连接一种单链接头；(3)对连接单链接头的单链DNA用DNA聚合酶延伸，使其成为双链DNA；(4)向双链DNA的另一端连接T接头或者Tn5标签接头；(5)通过PCR扩增两端连接接头的双链DNA，使其成为下一代测序技术可测序的DNA文库。本发明专利技术的方法不仅可用于下一代测序文库的构建，测定DNA序列，还可以鉴定染色质开放区、基因表达检测、微量核酸扩增等，是一种在核酸检测分析领域具有多种功能和广泛应用价值的新方法。

The construction method and application of a next generation sequence library based on single chain connection

The invention discloses a method for constructing next generation sequencing library and its application based on the single joint, the method comprises the following steps (1) the double stranded DNA fragments or RNA/DNA heterozygote fragments degeneration, make it become the single stranded DNA; (2) a single connection joint in single stranded DNA 3 'end (; 3) of single stranded DNA connection joint with DNA single strand polymerase extension, the double stranded DNA; (4) to the other end is connected with a T connector or Tn5 label joint double stranded DNA; (5) joint ends of double stranded DNA was amplified by PCR, the DNA library next generation sequencing technology sequencing. The method of the invention not only can be used for the construction of the next generation sequencing library, sequencing DNA, can also open area, qualitative identification stain gene expression detection, trace nucleic acid amplification, is a new method with multiple functions and wide application value in the field of nucleic acid detection analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法及其应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种基于单链接头文库制备(SinglestrandAdaptorLibraryPreparation，SALP)的下一代测序(next-generationsequencing,NGS)文库的构建方法及其应用。
技术介绍
自从2005年下一代测序(next-generationsequencing,NGS)出现在市场上以来，这项技术改变了我们在基础、应用和临床研究领域对科学研究方法的看法。随着各种新方法和计算机运算能力的不断发展，NGS平台推动了过去几年生物学知识的爆炸式增长。作为NGS最主要的应用，人类基因组的重测序极大的加深了我们对遗传多样性与健康、疾病之间相互关系的认识。NGS与传统的Sanger测序相比，最大的不同在于NGS需要制备测序文库。随着NGS测序平台数据量产出不断增加，以及各种相关硬件和软件的不断优化，测序文库的制备已经成为应用这项技术的瓶颈。现有的标准建库流程全部在体外(invitro)进行，主要步骤包括：DNA片段化(超声或酶切)(DNAfragmentation)、末端修平(endpolishing)、加A(Atailing)、Y接头连接(adaptorligation)、片段选择(sizeselection)，以及PCR扩增(PCRamplification)。标准建库流程冗长繁琐，许多步骤都需要进行优化，导致样品大量损失。特别是，该建库过程中，为了接头连接步骤的效率，接头连接前须对DNA片段进行多酶混合物处理的末端修平(endpolishing)(使DNA片段的两端均成为平末端(bluntend))步骤，以及必不可少的末端加A(Atailing)步骤。虽然有不少公司推出了这些步骤的合并或优化方法，也推出了类似Y接头(如颈环接头)的接头连接等方法，但建库技术没有从根本上得到改变。此外，该种建库方法中，广泛采用了Y型接头，直到最后的PCR步骤才用带有Index的PCR引物进行不同DNA样品的区分，之后混合进行同一通道(lane)的测序。这种每个DNA样品单独经历整个建库建库流程才能混合测序的方法，极大地增大了操作的复杂性、试剂及人力消耗，不仅建库成本高，而且易于造成不同DNA样品在建库期间的人为偏差(bias)，不利于不同样品间的测序结果的平行比较。为了克服标准建库流程的上述缺点，一种基于Tn5转座体(transposome)切贴技术的NGS建库方法被开发出来。在该方法中，两个包含引物退火位点的mosaicend(ME)接头首先与高活性的Tn5转座酶组装形成转座体，该转座体能够将DNA片段化并将接头连接至DNA的5′端(该过程被称之为“切贴”(cutandpaste)；专有英文术语为“tagmentation”)。最后，DNA片段通过特定的引物进行低循环次数的PCR扩增，产生与高通量测序平台(如Illumina)兼容的文库。然而，当运用该方法进行文库制备时，由于Tn5转座体切贴反应产生的部分DNA片段(理论上达50％)的两端带有相同的接头，因此只有部分DNA片段(理论上为50％)两端带有不同的接头序列，只有这部分DNA片段能够同时被两条不同的引物扩增并测序。尽管抑制PCR能够再DNA片段的DNA扩增过程中在一定程度可增加具有可测序结构的DNA片段的比例，但仍然使文库中的很多DNA片段无法测序，从而丢失大量信息。哺乳动物的生长和发育过程受到DNA结合蛋白与染色质之间的不断相互作用的调节。染色质能够以具有高度细胞特异性的方式限制转录因子与其DNA结合位点之间的结合，即染色质通过其开放状态决定转录因子与其DNA结合位点之间的结合。染色质的开放区提供了转录因子结合其位于染色质的开放区的DNA结合位点的机会，因此在基因表达调控中发挥重要作用。因此，染色质开放状态的鉴定对于发现基因调控区、解析基因表达的调控机理具有重要意义。近年来发展的基于Tn5转座体切割染色体的ATAC-seq(transposase-accessiblechromatinusingsequencing；转座酶可及染色质测序)技术，是一种能够快速、灵敏地捕获染色质开放区域的新方法，被广泛应用于不同条件下的染色质开放状态的研究。对染色质开放状态的研究同时也能够为发现导致疾病的重要调控元件提供有力帮助。例如，通过利用ATAC-seq鉴定比较食管癌细胞系以及食管癌病人组织样本的染色质开放状态差异，鉴定出转录因子AP1在食管癌的病程中起到关键作用，从而为食管癌的治疗发现了新的靶点。但因上述基于Tn5转座体切割建库方法的局限性，运用基于Tn5转座体切割染色质鉴定染色质开放区的ATAC-seq技术，也具有相同的缺点。由于基于Tn5转座体切割的建库方法不能测出所有DNA片段的序列，ATAC-seq技术会因建库流程而丢失部分开放区信息。
技术实现思路
专利技术目的：鉴于目前常用Y接头NGS文库构建方法、Tn5转座体NGS文库方法，以及基于Tn5转座体研究染色质开放区的ATAC-seq技术的上述缺陷及不足。本专利技术提供了一种基于单链接头(singlestrandadaptor，SSA)的下一代测序(NGS)文库的构建方法——单链接头文库制备(SinglestrandAdaptorLibraryPreparation，SALP)。本专利技术提出的SALP方法，不仅可用于NGS文库构建，测定DNA序列，还可以用于鉴定染色质开放区、基因表达检测(类似RNA-seq的功能)、微量核酸扩增等，因此是一种在核酸检测分析领域具有多种功能和广泛应用价值的新技术。本专利技术还提供SALP方法的应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种基于单链接头(SSA)的NGS文库构建方法——即SALP，其特征在于，包括以下步骤：(1)将双链DNA(dsDNA)片段或RNA/DNA杂合体片段变性，使其成为单链DNA(ssDNA)；(2)在单链DNA的3′端连接一种单链接头；(3)对连接单链接头的单链DNA用DNA聚合酶延伸，使其成为双链DNA；(4)向双链DNA的无单链接头的一端(连接T接头或者Tn5标签接头；(5)通过PCR扩增两端连接接头的双链DNA，使其成为下一代测序(NGS)可测序的DNA文库。其中，步骤(1)所述dsDNA片段为任何dsDNA片段，包括双链DNA片段包括超声波剪切的DNA片段、各种酶切产生的DNA片段、基于转座体片段化产生的DNA片段或自然降解的DNA片段。其中dsDNA指基因组DNA(gDNA)，其被各种方法剪切成为dsDNA片段，用该建库方法建库并高通量测序时，可用于全基因DNA测序分析或特定目标gDNA(如处于染色质开放区的gDNA)的测序分析。其中，所述自然降解的DNA片段为血液等体液中自然产生的循环游离DNA(cfDNA)及循环肿瘤DNA(ctDNA)。使用cfDNA及ctDNA建库时，所扩增的DNA不仅可用于高通量测序分析，亦可用于进一步低通量检测，如特定基因或DNA片段的PCR扩增和突变检测；此时该建库方法的应用价值则成为一种微量核酸样品的扩增放大技术。作为优选，所述转座体为由Tn5转座酶与Tn5标签接头组装成形成的转座体。进一步地，所述步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将双链DNA片段或RNA/DNA杂合体片段变性，使其成为单链DNA；(2)在单链DNA的3′端连接一种单链接头；(3)对连接单链接头的单链DNA用DNA聚合酶延伸，使其成为双链DNA；(4)向双链DNA的无单链接头的一端连接T接头或者Tn5标签接头；(5)通过PCR扩增两端连接接头的双链DNA，使其成为下一代测序可测序的DNA文库。

【技术特征摘要】
1.一种基于单链接头的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将双链DNA片段或RNA/DNA杂合体片段变性，使其成为单链DNA；(2)在单链DNA的3′端连接一种单链接头；(3)对连接单链接头的单链DNA用DNA聚合酶延伸，使其成为双链DNA；(4)向双链DNA的无单链接头的一端连接T接头或者Tn5标签接头；(5)通过PCR扩增两端连接接头的双链DNA，使其成为下一代测序可测序的DNA文库。2.根据权利要求1所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述双链DNA片段包括超声波剪切的DNA片段、各种酶切产生的DNA片段、基于转座体片段化产生的DNA片段或自然降解的DNA片段。3.根据权利要求2所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述转座体为由Tn5转座酶与Tn5标签接头组装形成的转座体。4.根据权利要求1-3任一所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)双链DNA片段为基于转座体片段化产生的DNA片段时，步骤(4)向双链DNA的另一端连接Tn5标签接头。5.根据权利要求3所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述Tn5标签接头，其序列结构为：5′-引物退火位点序列-标签序列-ME序列-3′；所述ME序列为双链，引物退火位点序列及标签序列可为单链或双链；双链ME序列的3′端为羟基、5′端为磷酸基；其中ME序列的一条链为5′-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′，另一条互补链为5′-P-CTGTCTCTTATACACATCT-3′，其中P表示磷酸基。6.根据权利要求1所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述RNA/DNA杂合体为用反转录反应产生的RNA/DNA杂合体；其变性产生的单链DNA为互补DNA。7.根据权利要求1所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述单链接头为一段带有粘性末端的双链寡核苷酸；该单链接头的粘性末端为3′端突出的数个随机核苷酸；该单链接头的另一3′端为基团封闭的平末端。8.根据权利要求7所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述3′端突出的数个随机核苷酸，其长度为1～4个核苷酸。9.根据权利要求7所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述粘性末端的5′端为磷酸基团，所述平末端的5′端为羟基基团。10.根据权利要求1所述的构建下一代测序文库的方法，其特征在于，步骤(2)所述在单链DNA的3′端连接一种单链接头，为单链接头的粘性末端与步骤(1)产生的单链DNA的3′端退火，再由核酸连接酶催化单链接头的粘性末端的5′端磷酸基团与步骤(1)产生的单链DNA的3′端羟基基团形成3′-5′磷酸二酯键。11.根据权利要求1所述的下一代测序文库的构建方法，其特征在于，所述单链接头为单链标签接头，即在单链接头的双链区中加入标签序列，且标签序列靠近3′端突出的随机核苷酸。12.根据权利要求1所述的构建下一代测序文库...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，武剑，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32