本发明专利技术公开了一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法。ubiG、ubiE和dxsA是类球红细菌Rhodobacter sphaeroides辅酶Q10合成途径中三个重要的催化酶基因,分别编码3‑去甲基泛醌‑9 3‑甲基转移酶、甲基萘醌甲基转移酶和1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合成酶。利用PCR技术扩增类球红细菌辅酶Q10生物合成途径中三个重要的催化酶基因ubiG、ubiE和dxsA,再将三个基因克隆到质粒DNA表达载体pRKpuf,获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的表达载体pRKpuf‑ubiE‑ubiG‑dxsA。通过大肠杆菌S17‑1将表达载体转化到类球红细菌中获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA基因的工程菌,最后利用工程菌发酵生产辅酶Q10。该发明专利技术提供了一种增加辅酶Q10产量的方法,能将辅酶Q10的产量提高约80%,适合辅酶Q10大规模工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法
本专利技术涉及一种生物表达载体,尤其涉及一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建。
技术介绍
类球红细菌广泛分布于淡水、海水、极地或温泉(包括高热水体)以及高盐、高有机质含量等不同的生态环境中,是一类进行不产氧光合作用,具有复杂代谢功能的微生物。辅酶Q10(CoQ10)是一种良好的生化药物,具有提高人体免疫力、增强抗氧化能力、延缓衰老的功能,其应用已经扩展到化妆品和保健品领域,市场前景十分广阔。本专利技术利用PCR技术扩增类球红细菌Rhodobactersphaeroides辅酶Q10合成途径中的关键酶基因ubiG、ubiE和dxsA,再将三个基因克隆到质粒DNA表达载体pRKpuf,获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的表达载体pRKpuf-ubiE-ubiG-dxsA。利用接合转移技术将质粒DNA表达载体转化到类球红细菌中获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的工程菌。本专利技术针对微生物发酵法生产辅酶Q10产量较低且生产成本较高等缺点,提供了一种能够显著提高辅酶Q10产量的辅酶Q10工程菌及其构建方法。通过引用该方法,可以提高应用微生物发酵法生产辅酶Q10的产量,同时降低了生产辅酶Q10的成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案是:一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法,步骤包括:(1)从类球红细菌中提取基因组DNA;(2)用PCR技术扩增出关键基因ubiG、ubiE和dxsA;(3)将ubiG、ubiE和dxsA连接到表达载体上,得到同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的表达载体pRKpuf-ubiE-ubiG-dxsA;(4)利用接合转移技术将表达载体转化到类球红细菌获得同时过量表达ubiE、ubiG和dxsA基因的工程菌。进一步的,步骤(2)中,所述ubiG、ubiE和dxsA扩增设计三对PCR引物ubiG-F和ubiG-R、ubiG-F和ubiG-R和dxsA-F和dxsA-R:ubiG-F的5′端含有酶切位点XbaI,ubiG-R的5′端含有酶切位点BamHI,引物序列为:ubiG-F:5'-GCTCTAGAGAATCGTCCAGCACCATCGACC-3',ubiG-R:5'-CGGGATCCTCAGCTGCGCCGCACGC-3';ubiE-F的5′端含有酶切位点BamHI,ubiE-R的5′端含有酶切位点KpnI,引物序列为:ubiE-F:5'-CGGGATCCATGAGCGACGAAACTTCC-3',ubiE-R:5'-GGGGTACCTCAGATCTTCCAGCCGG-3';dxsA-F的5′端含有酶切位点KpnI,ubiE-R的5′端含有酶切位点EcoRI,引物序列为:dxsA-F:5'-GGGGTACCATGACCAATCCCACCCCGC-3',dxsA-R:5'-GGAATTCTCAGACCGCCCGCGGCT-3'。进一步的,步骤(2)中,ubiG基因序列如SEQIDNO.1所示,ubiE基因序列如SEQIDNO.2所示,dxsA基因序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的有益技术效果是:本专利技术的目的是以类球红细菌的基因组DNA为模板来进行PCR扩增。将扩增回收得到的ubiG、ubiE和dxsA利用连接酶分别连接到pMD18-T载体中再进行测序分析。将测序正确的ubiG、ubiE和dxsA片段依次连接到表达载体pRKpuf获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的质粒表达载体pRKpuf-ubiG-ubiE-dxsA,再转化到大肠杆菌S17-1中,最后利用接合转移技术将质粒表达载体转化到类球红细菌中获得同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的工程菌,将该专利技术由于微生物发酵生产辅酶Q10的过程中,辅酶Q10的产量提高了约80%,具有较高的应用价值和工业实用性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为以类球红细菌为基因组DNA为模板扩增ubiG、ubiE和dxsA的图;图2为pRKpuf-ubiG的菌落PCR验证图;图3为pRKpuf-ubiG-ubiE的菌落PCR验证图;图4为pRKpuf-ubiG-ubiE-dxsA的菌落PCR验证图;图5为原始类球红细菌、只含pRKpuf的转化菌、含pRKpuf-ubiG-ubiE-dxsA基因的工程菌提取辅酶Q10的产量图;图6为本专利技术的步骤示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图,对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。材料:1.PrimeSTARTMHSDNA聚合酶(Takara公司产品,中国大连)2.各种限制性内切酶(Takara公司产品,中国大连)3.连接试剂盒DNALigationKitVer.2.0(Takara公司产品,中国大连)4.DNA纯化试剂盒、离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代公司产品,中国北京)5.DNA提取试剂盒UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(Takara公司产品,中国大连)6.大肠杆菌S17-1(实验室保存)7.大肠杆菌DH5α(实验室保存)8.类球红细菌Rhodobactersphaeroides(实验室保存)注:以下试剂均为市售产品。9.LB培养基酵母提取物5g胰蛋白胨10gNaCl10g固体培养基:加入2%(w/v)琼脂粉溶于1000mL去离子水中,并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0,高压蒸汽灭菌。10.培养基(1L)1L超纯H2O溶解注意:用NaOH调节pH至6.90,121℃、15分钟湿热灭菌,灭菌后与20ml50xPhosphate-Solution和8mlVitamine-Solution混匀使用。TraceMetalSolution1L超纯H2O溶解注意:称取柠檬酸铁于盛有适量超纯水的锥形瓶中,微波炉加热溶解,然后冷却至室温,然后加其他微量元素。4℃、黑暗条件下储存。50xPhosphateSolutionK2HPO445gKH2PO430g1L超纯H2O溶解注意:根据用量配制,121℃、灭菌15min。VitamineSolution1L超纯H2O溶解注意:过滤灭菌,4℃保存。固体培养基按16g/L加琼脂粉。实施例1类球红细菌ubiG、ubiE和dxsA的PCR扩增和连接按照DNA提取试剂盒的操作说明,提取类球红细菌基因组DNA,根据GenBank上报道的类球红细菌基因序列设计三对PCR引物ubiG-F和ubiG-R、ubiG-F和ubiG-R和dxsA-F和dxsA-R。ubiG-F的5′端含本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法,其特征在于,步骤包括:(1)从类球红细菌中提取基因组DNA;(2)用PCR技术扩增出关键基因ubiG、ubiE和dxsA;(3)将ubiG、ubiE和dxsA连接到表达载体上,得到同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的表达载体pRKpuf‑ubiE‑ubiG‑dxsA;(4)利用接合转移技术将表达载体转化到类球红细菌获得同时过量表达ubiE、ubiG和dxsA基因的工程菌。
【技术特征摘要】
1.一种提高类球红细菌辅酶Q10产量的质粒表达载体的构建方法,其特征在于,步骤包括:(1)从类球红细菌中提取基因组DNA;(2)用PCR技术扩增出关键基因ubiG、ubiE和dxsA;(3)将ubiG、ubiE和dxsA连接到表达载体上,得到同时过量表达ubiG、ubiE和dxsA的表达载体pRKpuf-ubiE-ubiG-dxsA;(4)利用接合转移技术将表达载体转化到类球红细菌获得同时过量表达ubiE、ubiG和dxsA基因的工程菌。2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(2)中,所述ubiG、ubiE和dxsA扩增设计三对PCR引物ubiG-F和ubiG-R、ubiG-F和ubiG-R和dxsA-F和dxsA-R:ubiG-F的5′端含有酶切位点XbaI,ubiG-R的5′端含有酶切位点BamHI,引物序列为:ubiG-F:5'-GCTCTAGAGAATCGTCCAGCA...
【专利技术属性】
技术研发人员:赵志平,王娟,聂鑫,唐阔,
申请(专利权)人:四川理工学院,
类型:发明
国别省市:四川,51
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