一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于基因工程和发酵工程领域。本发明专利技术以解脂耶氏酵母为宿主，构建了高产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌po1h/hpro‑mTG。该菌株产酶水平高，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL。通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro‑mTG，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL。本发明专利技术构建的重组菌发酵产酶水平高，可降低谷氨酰胺转氨酶的生产成本，利于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体
本专利技术涉及一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体，属于酶工程领域。
技术介绍
谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC2.3.2.13,TGase)，可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸(如赖氨酸)交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。微生物具有生产成本低、易于培养和改造等优点，所以生产上主要依赖微生物来生产TGase。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原(pro-MTG)的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性MTG。酶原区(pro)位于信号肽与成熟酶之间，属于前导肽，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。有些链霉菌如Streptomyceslividans3113、Streptomycesladakanum等，其自身可以表达活化MTG的蛋白酶，因而可以表达活性MTG，但是MTG酶活相对较低，普遍在1.0-6.0U/mL。近年来利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌等异源宿主中表达MTG成为了一种新的趋势，然而，一方面，大肠杆菌等异源宿主是非食品级表达体系，另一方面，在异源宿主中，谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原的形式分泌，需在体外经蛋白酶TAMEP，SAM-P45，dispase等切除N-端酶原区(pro)才能转化成活性谷氨酰胺转氨酶。且重组菌生产谷氨酰胺转氨酶的产量普遍较低，如刘松的《Overproductionofpro-transglutaminasefromStreptomyceshygroscopicusinYarrowialipolyticaanditsbiochemicalcharacterization》中将吸水链霉菌来源的pro-TGase的突变体N355Q异源表达得到重组菌产量可达35U/mL，重组菌产谷氨酰胺转氨酶的产量有提升较小。因此，如何在食品级表达体系中稳定、的直接表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。另外，如果在异源宿主中可以直接表达活性谷氨酰胺转氨酶，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本，一举两得。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种以活性形式表达的谷氨酰胺转氨酶的突变体。本专利技术第一个目的是提供一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种高效表达所述突变体的重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以解脂耶氏酵母po1h为宿主。本专利技术第三个目的是提供一种所述的重组菌的构建方法是，具体步骤如下：(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2，所述吸水链霉菌来源的酶原区谷氨酰胺转氨酶hpro的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得重组菌po1h/hpro-mTG。本专利技术的第四个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌，所述重组菌共表达蛋白酶TAMEP和hpro-mTG，所述蛋白酶TAMEP的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述hpro-mTG的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第五个目的是提供一种表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌的构建方法，具体步骤如下：将氨基酸序列为SEQIDNO.4的蛋白酶TAMEP的基因构建质粒pINA1297/HT，将质粒线性化后转化到重组菌po1h/hpro-mTG中，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，得到表达活性谷氨酰胺转氨酶的重组菌po1h/HM+HT。本专利技术第六个目的是提供一种所述重组菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶的方法，所述方法的步骤如下：(1)摇瓶培养：将重组菌接种于YPD液体培养基中，培养25-30℃，180-230rpm培养20-27h后，按8-12％的接种量转接于解脂耶氏酵母发酵培养基中，25℃-30℃，180-230rpm摇瓶培养4-6d。(2)发酵罐培养方法：将重组菌接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h后，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。重组菌po1h/hpro-mTG接种于YPD液体培养基中，28℃，200rpm培养24h，种子液以10％的接种量接种至发酵罐中，控制温度28℃，搅拌转速为600rpm，通气量为2vvm。当溶氧开始反弹且>60％时，开始流加50％(W/V)甘油120mL，调节转速使溶氧<30％，发酵120h。发酵液于4℃，4000rpm离心10min，上清液即为胞外粗酶液，经dispase活化后，测酶活。经检测酶活最高可达43.7U/mL。本专利技术的有益效果：1.本专利技术通过改造茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区，得到了一种高产谷氨酰胺转氨酶的突变体，摇瓶发酵酶活可达11.7U/mL，较改造前提高了106倍，发酵罐发酵酶活可以达到43.7U/mL，为目前所报道的最高水平；通过共表达蛋白酶TAMEP和hpro-mTG，摇瓶发酵酶活可达6.7U/mL，发酵罐发酵酶活达到21.4U/mL，实现了谷氨酰胺转氨酶的活性表达，无需经酶切处理，不仅可以简化生产步骤，还能降低生产成本。2.解脂耶氏酵母为食品级表达体系(已被FDA认定是安全的)，发酵中不需诱导或添加抗生素，能用于食品和药品的生产。易于培养，发酵方法简单，周期短。高密度发酵，分泌能力强，利于大量表达谷氨酰胺转氨酶。本专利技术采用的po1h系的解脂耶氏酵母已敲除胞外蛋白酶基因，所以胞外几乎无杂蛋白，易于谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。3.本专利技术使用的谷氨酰胺转氨酶基因来源于茂源链霉菌，pH适应范围广，稳定性高(pH适应范围为5-9，最适反应pH范围为6-7，最适反应温度为55℃)。附图说明图1：重组菌发酵mTG酶活图2：重组菌发酵上清SDS-PAGE图图3：活性表达重组菌产mTG酶活图4：活性表达mTG重组菌发酵上清SDS-PAGE图具体实施方式培养基：LB培养基：YeastExtract5g/L，Tryptone10g/L，NaCl10g/L。YPD培养基：YeastExtract10g/L，Tryptone20g/L，葡萄糖20g/L。YNB培养基：YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L。固体培养基则是在液体培养基中加2％的琼脂。发酵培养基：甘油15g/L，酵母粉20g/L，氯化铵2.64g/L，磷酸二氢钾0.32g/L，无水硫酸镁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，为以下(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种高效表达的谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，为以下(a)或(b)：(a)由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有谷氨酰胺转氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。3.表达权利要求1所述突变体的重组菌。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，以解脂耶氏酵母po1h为宿主。5.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，构建方法是：将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，将重组质粒线性化后转到宿主菌中，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。6.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，构建方法是：(1)将茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶基因和吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro基因融合后与载体连接，构建质粒pINA1297/hpro-mTG，所述茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2，所述吸水链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶酶原区hpro的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；(2)重组质粒pINA1297/hpro-mTG线性化后，转化到解脂耶氏酵母po1h，经营养缺陷型培养基YNB筛选后，获得重组菌po1h...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，任蕊蕊，李江华，陈坚，堵国成，石诚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32