一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2‑SH，所述化合物包括以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述二氧化硅外壳在三甲氧基甲硅烷的作用下使其携带硫醇基团而具有功能化，并可携带不同荧光染料，如FITC,Cy5等。进一步的，本发明专利技术还提供了上述化合物的制备方法以及医药用途。本发明专利技术的纳米颗粒性质稳定，细胞毒性较小，并可携带不同荧光染料，可以该纳米颗粒为载体，有效实现poly(I:C)与TLR3结合，通过激活TLR3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生，因此有望作为药物体内成像和疫苗的载体。

A nanoparticle carrier containing TLR3 ligand in pattern recognition receptor and its preparation and Application

The invention provides a method of pattern recognition receptors containing the TLR3 ligand in the nanoparticles of CaP/PEI/poly (I:C) /SiO2 SH, the compounds including calcium phosphate nanoparticles as the core, the surface grafting kernel PEI, kernel surface absorption of Poly (I:C), kernel outer silica shell, the silica shell in trimethoxysilane under the action of the thiol groups and has the function of carrying, and can carry different fluorescent dyes, such as FITC, Cy5 etc.. Further, the invention also provides a preparation method of the compound and the use of the medicine. The invention of the nanoparticles is stable, less cytotoxic, and can carry different fluorescent dyes, the nano particles as the carrier, the effective implementation of poly (I:C) combined with TLR3, through the activation of the TLR3 mediated signal pathway, interferon and enhanced the production of pro-inflammatory cytokines, so it can be used as vaccine carrier imaging and in vivo drug.

【技术实现步骤摘要】
一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及医药
，具体涉及一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用。
技术介绍
在多种纳米颗粒中，磷酸钙纳米颗粒具有高生物相容性、高生物降解性、体积小以及高亲和力，可与一些核酸共价功能化等特性，因其有可观的应用前景。该纳米颗粒已被用于各种领域,如转染、基因沉默、药物传输、光动力治疗等。一些大分子物质常常无法穿透细胞膜,因此,一个有效的载体如纳米颗粒是必需的。磷酸钙纳米颗粒的大小约100纳米很容易被细胞摄取，随后溶解在溶酶体中。多项研究证实多壳包裹的磷酸钙纳米颗粒可在免疫学中用途广泛,例如用于预防性和治疗性免疫和特定的B细胞活化。对许多病毒感染,目前还缺乏有效的预防性或治疗性疫苗(如艾滋病毒、乙肝病毒和丙肝病毒感染)。用于预防或治疗病毒性疾病的疫苗通常是减毒活疫苗病毒或灭活病原体。理想的疫苗应该提供抗原和佐剂并能保护这些免疫激活生物分子,防止这些分子在达到他们的目标细胞前降解。这意味着疫苗运载系统应该模拟自然病原体的成分和免疫过程。天然免疫针对的主要靶分子称为病原相关分子模式(PAMP)，相对应的识别受体称为模式识别受体(PRR)。PAMP主要指病原体细胞表面的分子或核酸成分，它们在进化中趋于保守，是病原体生存所必须得。来源于病原体的核酸，包括单链和双链RNA，是PAMP的其中一大类。TLR是PRR中的一大家族，TLR3位于细胞内，能够识别病毒的双链RNA。人工合成的双链RNA类似物聚肌胞胞苷酸(poly(I:C))，为TLR3的配体，能够被TLR3识别并激活TLR3，另外poly(I:C)还能被黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)所识别。TLR3在胞内识别poly(I:C)并被其激活后，能够募集下游的衔接蛋白MyD88和TRIF，TLR3可通过MyD88依赖途径诱导炎症性细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-6和IL-12的表达，参与非特异性抗病毒反应，同时通过MyD88非依赖途径诱导共刺激分子CD80和CD86以及IFN-β、IP-10等抗病毒性细胞因子的表达，参与诱导DC的分化成熟以及抗病毒免疫反应。胞质的MDA-5可在线粒体外模被线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)所招募。MDA-5虽然与TLR3利用的是不同的衔接蛋白，但下游的信号通路是相同的，都能激活一系列的转录因子，包括IRF3,IRF7和NF-κB，诱导抗炎或促炎因子(IL-6,IL-10),I型干扰素(IFN-α/β)以及共刺激分子的表达。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和医药用途。本专利技术第一方面提供了一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体的制备方法，其特征在于，步骤包括：S1、制备CaP/PEI：制备PEI-磷酸钙纳米颗粒；S2、制备CaP/PEI/poly(I:C)：将步骤S1制备得到的PEI-磷酸钙纳米颗粒与水溶的poly(I:C)或含荧光素的poly(I:C)混合，15～35℃下搅拌，得到负载有poly(I:C)的PEI-磷酸钙纳米颗粒；S3、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2：将步骤S2所得CaP/PEI/poly(I:C)、四乙氧基硅烷、氨水、溶剂充分混合，15～35℃下搅拌混合液14～18小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒，再将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒溶解于超纯水中；S4、将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒共价功能化，使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表面共价结合硫醇基团或氨基基团。我们设计的磷酸钙纳米颗粒包含以下成分:磷酸钙的核心载体,Cy5-dye在体外和体内作为成像工具,最后poly(I:C)作为佐剂用于刺激和免疫。我们检测了纳米颗粒的大小,光谱特性,和在体外和体内(老鼠)进入细胞和器官的内化率。此外,我们也证实了纳米颗粒刺激主要相关的细胞,即肝细胞和肝窦内皮细胞(LSEC)的能力。本专利技术的研究中发现，人工合成的双链RNA类似物聚肌胞胞苷酸(poly(I:C))可以与TLR3结合，通过激活TLR3介导的信号通路，增强干扰素和促炎因子的产生，纳米颗粒可以作为有效的载体使poly(I:C)靶向在体内外激活TLR3通路。纳米级药物载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。因此，本专利技术中我们将纳米颗粒作为载体与poly(I:C)结合起来，使该种纳米颗粒携带的poly(I:C)激活TLR3通路引发相关的天然免疫应答，该纳米颗粒还可结合在特定的细胞或组织中，可在体外和体内作为成像工具。因此，上述纳米颗粒载体有望开发成为一种预防或者治疗可对TLR3信号通路激活起反应的疾病的药物或保健品，并可在体外和体内作为成像工具，本专利技术也提供了上述纳米颗粒载体的医药用途。优选的，步骤S1所述制备PEI-磷酸钙纳米颗粒的步骤包括：以体积比5:5:7的比例，向超纯水中注入水溶的乳酸钙、(NH4)2HPO4和PEI，搅拌。所述水溶的PEI浓度为2g/L，水溶的乳酸钙(18mmol/L,pH＝10)、(NH4)2HPO4(10.8mmol/L,pH＝10)；所述超纯水的用量为水溶的乳酸钙体积的四倍。优选的，步骤S4所述使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表面共价结合硫醇基团的步骤包括：制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-SH：将三甲氧基甲硅烷溶于溶剂，再向其中加入溶解于超纯水中的CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒，15～35℃下搅拌8～10小时，离心收集沉淀得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-SH颗粒，再将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2-SH颗粒溶解于超纯水中。优选的，所述离心在离心力66000g下超速离心30min。通过超速离心法分离出目标纳米颗粒，用声波破碎法再将目标纳米颗粒溶解于超纯水中。通过以上的方法，未反应的母体化合物以及副产品都能被有效去除掉。本专利技术第二方面提供了一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体，所述纳米颗粒载体以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述外壳的二氧化硅共价结合有硫醇基团或氨基基团。优选的，所述包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体采用上述制备方法制备得到。本专利技术第三方面提供了包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体在制备TLR3激动剂中的应用。本专利技术第四方面提供了包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体在制备预防或治疗可对TLR3激动剂起反应的疾病的药物或保健品中的应用。本专利技术第五方面提供了一种激活TLR3的方法，步骤包括：将表达TLR3的细胞与包含相关细胞配体Poly(I:C)的纳米颗粒载体接触,并可在体外和体内作为成像工具。本专利技术第六方面提供了一种药物组合物，组份包括包含模式识别受体中TLR3的配体的纳米颗粒载体用于病毒感染性疾病。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体，其特征在于：所述纳米颗粒载体以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述外壳的二氧化硅共价结合有硫醇基团或氨基基团。

【技术特征摘要】
1.一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体，其特征在于：所述纳米颗粒载体以磷酸钙纳米颗粒为内核，内核表面接枝有PEI，内核表面吸附载有Poly(I:C)，内核外部为二氧化硅外壳，所述外壳的二氧化硅共价结合有硫醇基团或氨基基团。2.一种包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体的制备方法，步骤包括：S1、制备CaP/PEI：制备PEI-磷酸钙纳米颗粒；S2、制备CaP/PEI/poly(I:C)：将步骤S1制备得到的PEI-磷酸钙纳米颗粒与水溶的poly(I:C)或含荧光素的poly(I:C)混合，15～35℃下搅拌，得到负载有poly(I:C)的PEI-磷酸钙纳米颗粒；S3、制备CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2：将步骤S2所得CaP/PEI/poly(I:C)、四乙氧基硅烷、氨水、溶剂充分混合，15～35℃下搅拌混合液14～18小时，离心分离得到CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒，再将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒溶解于超纯水中；S4、将CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒共价功能化，使CaP/PEI/poly(I:C)/SiO2颗粒表面共价结合硫醇基团或氨基基团。3.如权利要求2所述的包含模式识别受体中TLR3配体的纳米颗粒载体的制备方法，其特征在于：步骤S1所述制备PEI-磷酸钙纳米颗粒的步骤包括：以体积比5:5:7的比例，向超纯水中注入水...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴珺，邹诗，黄顺梅，杜艳芹，马赛厄斯·埃普尔，维多利亚·索科洛娃，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42