一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球作为标记物，制备了一种检测肿瘤标志物抗原的电化学免疫传感器，实现了常见肝癌肿瘤标记物AFP、CEA的检测，具有特异性强，灵敏度高，检测限低，具有重要的科学意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于新型功能材料与生物传感检测
，提供了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球作为检测抗体标记物，制备了一种检测肿瘤标志物抗原的电化学免疫传感器。
技术介绍
肝癌是一种对人体危害很大的疾病，也是所有癌症中死亡率，死亡速度最快的恶性肿瘤之一。肝癌癌肿瘤标志物AFP、CEA的灵敏检测，在临床上对于肿瘤的早期发现，肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断，肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响，引起人们的广泛关注。目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，夹心型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。本专利技术成功构建了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。聚多巴胺功能化的酚醛树脂硬碳微球是三维的微孔球状结构，多孔结构能够促进电活性物质的在材料表面的吸附，缩短离子在孔径间的传输距离，减小材料的电荷转移电阻，提高了导电性能。功能化后的碳球能与贵金属纳米粒子形成稳定的化学键，能有效吸附贵金属纳米粒子，同时还能减小纳米粒子的团聚效应。金银核壳纳米粒子相对于单金属纳米粒子，拥有更多的催化点位，对过氧化氢的还原反应表现出协同催化作用，大大提高了材料的电催化性能。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。本专利技术的目的之一是提供一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的之二是将所制备的基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。本专利技术的技术方案，包括以下步骤。1.一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将上述玻碳电极置于0.1%的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2V下，运行30~35s；（3）继续将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.8~1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、20fg/mL~100ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中干燥；（6）将6µL、1~3mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。2.所述的Au@AgNPs，制备步骤如下：将64mL、1~3mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115°C回流加热10~15min,加入12.5~13.5mL、38.8mmol/L的柠檬酸钠，至溶液颜色有黄色变为酒红色，制得AuNPs溶液；取5~7mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的400~600μL、7.1mmol/L的硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。3.所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，制备步骤如下：（1）酚醛树脂微孔碳球的制备取20mL超纯水水，8mL无水乙醇，0.1mL、质量分数为25%的氨水加入烧杯中，搅拌10~20min；依次加入0.2~0.4g苯酚和0.25~0.35mL、质量分数为37%的甲醛溶液，在30°C恒温水浴下搅拌反应24h；将转移到聚四氟乙烯高压釜中100°C下老化24h，离心洗涤，所得固体在40°C真空干燥箱中干燥16~24h；将干燥好的固体与KOH按质量比4：1混合，研磨1h，进行活化处理，后放入管式电阻炉内在氮气的保护下进行碳化；碳化完成后，从电阻炉内取出，用10%的盐酸浸泡1h，离心洗涤，干燥，备用；所述碳化具体步骤如下：以1°C/min的速度升温至350°C，恒温保持1h；然后以2°C/min升温至700°C，恒温保持2h；后冷却至室温；（2）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的制备将30~50mg的酚醛树脂微孔碳球超声分散在15mL、10mmol/L的pH=8.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，加入10~15mg的盐酸多巴胺，在室温条件下震荡24h；加入5~7mL的上述制备的Au@AgNPs继续震荡1h；用超纯水离心洗涤三次，40°C真空干燥箱中干燥16~20h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球固体粉末；（3）负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液的制备将2~6mg的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球超声分散于1mL的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入100μL、80~120μg/mL的肿瘤标志物检测抗体溶液和900μL、50mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，4°C恒温振荡培养箱中振荡，孵化12h，制得负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，4°C下保存备用。4.肿瘤标志物的检测，步骤如下：（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH=5.6~8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间400s；（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；（4）利用工作曲线法，得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。上述所述肿瘤标志物选自AFP或CEA。本专利技术所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。本专利技术的有益成果（1）采用负载Au@AgNPs的聚多巴胺功能化的酚醛树脂微孔碳球作为抗体标记物。聚多巴胺功能化的酚醛树脂硬碳微球是三维的微孔球状结构，多孔结构能够促进电活性物质的在材料表面的吸附，缩短离子在孔径间的传输距离，减小材料的电荷转移电阻，提高了导电性能。碳球具有大的比表面积，功能化后的碳球能与贵金属纳米粒子形成稳定的化学键，能有效吸附贵金属纳米粒子，同时还能减小纳米粒子的团聚效应。金银核壳纳米粒子相对于单金属纳米粒子，拥有更多的催化点位，对过氧化氢的还原反应表现出协同催化作用，大大提高了材料的电催化性能。（2）一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器对肿瘤标志物的检测，对AFP其线性范围20fg/mL~100ng/mL，检测限为6.7fg/mL；对CEA其线性范围30fg/mL~本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将上述玻碳电极置于0.1 %的HAuCl4溶液中，采用i‑t法，在‑0.2 V下，运行30 ~ 35 s；（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 °C冰箱中干燥；（4）继续将3 µL、0.8 ~ 1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中晾干；（5）滴加6 µL、20 fg/mL ~ 100 ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 °C冰箱中干燥；（6）将6 µL、1 ~ 3 mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将上述玻碳电极置于0.1%的HAuCl4溶液中，采用i-t法，在-0.2V下，运行30~35s；（3）继续将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体滴加到电极表面，超纯水冲洗，4°C冰箱中干燥；（4）继续将3µL、0.8~1.5mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中晾干；（5）滴加6µL、20fg/mL~100ng/mL的不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4°C冰箱中干燥；（6）将6µL、1~3mg/mL的负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，滴涂于电极表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器。2.如权利要求1所述的一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，所述的Au@AgNPs，其特征在于，制备步骤如下：将64mL、1~3mmol/L的HAuCl4溶液加入三口圆底烧瓶，油浴115°C回流加热10~15min,加入12.5~13.5mL、38.8mmol/L的柠檬酸钠，至溶液颜色有黄色变为酒红色，制得AuNPs溶液；取5~7mL的上述制备的AuNPs溶液，加入将新配置的400~600μL、7.1mmol/L的硝酸银水溶液震荡，待溶液由酒红色变为红棕色，用超纯水离心洗涤三次，超声分散到10mL的超纯水中制得Au@AgNPs溶液，备用。3.如权利要求1所述的一种基于Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球的免疫传感器的制备方法，所述负载Au@AgNPs的功能化的酚醛树脂微孔碳球检测抗体孵化物溶液，其特征在于，制备步骤如下：（1）酚醛树脂微孔碳球的制备取20mL超纯水水，8mL无水乙醇，0.1mL、质量分数为25%的氨水加入烧杯中，搅拌10~20min；依次加入0.2~0.4g苯酚和0.25~0.35mL、质量分数为37%的甲醛溶液，在30°C恒温水浴下搅拌反应24h；将转移到聚四氟乙烯高压釜中100°C下老化2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李月云，张晓波，吕慧，王平，董云会，刘青，孔玲，陈志伟，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东,37