菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域，旨在提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SPI基因及应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由该基因体外原核表达获得的重组蛋白能够有效抑制其寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原的激活，从而抑制寄主血淋巴的黑化作用，减弱寄主的免疫反应，为获得新型转基因抗虫作物提供了序列参考。该重组蛋白能够抑制枯草杆菌蛋白酶A，胰蛋白酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，对于开发丝氨酸蛋白酶抑制剂类药物具有重要的意义。本发明专利技术能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT‑SPI重组蛋白，为进行CvT‑SPI的活性实验提供了便利。

Cotesiaplutellae teratocyte serine protease inhibitor CvT SPI gene and its application

The present invention relates to molecular biology, genetic engineering and protein engineering, aims to provide a vegetable moth Cotesia teratocyte serine protease inhibitor CvT SPI gene and its application. The gene nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 shown by the gene encoding protein, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2. The recombinant protein can effectively inhibit the activation of the host Plutella xylostella hemolymph propo prokaryotic expression of the gene in vitro, thus inhibiting host hemolymph melanization, weaken the immune responses of the host, provide a reference for obtaining new sequences of transgenic insect resistant crops. The recombinant protein can inhibit the activity of Bacillus subtilis A, trypsin and porcine pancreatic elastase, and is of great significance for the development of serine protease inhibitors. The invention can obtain large amounts of soluble CvT recombinant protein SPI in a short period of time, provides convenience for the activity experiments for CvT SPI.

【技术实现步骤摘要】
菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用
本专利技术涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及其编码的核酸序列和潜在应用价值。
技术介绍
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类分布广泛于植物、动物、微生物等中，是丝氨酸蛋白酶活性的调节剂。根据其序列的同源性、半光氨酸残基和分子中二硫键的数目，丝氨酸蛋白酶抑制剂可分为Kunitz、Kazal、Bowman-Birk、Serpin、TIL(TrypsinInhibitorLikeCysteineRichDomain)等几个家族。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与生物体内一系列的生理和病理过程的调控，如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等发挥着关键性的调控作用，从而维持生命体内稳态。丝氨酸蛋白酶抑制剂在在医学上具有很好的应用价值，丝氨酸蛋白酶抑制在临床上用于胃炎、胰腺炎等疾病的治疗已有报道。害虫一直严重危害着农作物的安全生产，给粮食生产带来了严重的损失，而长期以来害虫的防治主要依赖于化学农药，其后果是导致害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药残留以及环境污染等，迫切需要新的安全、高效、低毒的防治方法。随着转基因技术的发展，提供了一种新的害虫防治的新方法。菜蛾盘绒茧蜂(Cotesiavestalis)是防治小菜蛾(Plutellaxylostella)的主要优势寄生性天敌，寄生蜂利用多种寄生因子如毒液、多分DNA病毒、类病毒颗粒、畸形细胞等寄生因子破坏寄主免疫反应，调控寄主生长发育等以保证其后代在寄主血腔或者体表正常发育。畸形细胞(Teratocytes)是菜蛾盘绒茧蜂卵在寄主体内发育过程中由蜂卵的浆膜层解离下来的一种特殊细胞，畸形细胞能够分泌一些功能蛋白，其中也包括一些胞外丝氨酸蛋白酶抑制剂。将寄生蜂的寄生因子的基因结合转基因生物技术，有望用于获得新型转基因抗虫作物，为鳞翅目害虫生物防治开辟新的途径。目前，将红足侧沟茧蜂(Microplitisdemolitor)畸形细胞的分泌蛋白转入烟草，并使烟草天蛾(Manducasexta)生长明显缓慢，危害程度明显低于非转基因对照，使烟草具有抗虫性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因及应用。为解决技术问题，本专利技术的解决方案如下：提供一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术进一步提供了由前述基因编码的蛋白，其氨基酸序列与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有95％～100％同源性，是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。本专利技术进一步提供了由前述蛋白制得的重组蛋白，是将所述蛋白去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术中，所述重组蛋白的制备方法包括：将去除信号肽的序列用于构建原核表达载体，在蛋白的C-末端加上His-tag，并利用His-tag纯化重组蛋白。本专利技术进一步提供了前述重组蛋白在制备丝氨酸蛋白酶抑制剂药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因序列经基因数据库比对分析，未发现任何相同基因。本专利技术的菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因所编码的氨基酸序列进行蛋白数据库比对分析，未发现任何相同蛋白。2、本专利技术克隆了一个菜蛾盘绒茧蜂丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因的cDNA的全长，该基因编码的氨基酸序列比对结果显示，CvT-SPI含有一个TIL(TrypsinInhibitorLikeCysteineRichDomain)结构域，该菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶CvT-SPI基因体外原核表达获得的重组蛋白能够有效抑制其寄主小菜蛾血淋巴酚氧化酶原的激活，从而抑制寄主血淋巴的黑化作用，减弱寄主的免疫反应，为获得新型转基因抗虫作物提供了序列参考。同时，该重组蛋白能够抑制枯草杆菌蛋白酶A，胰蛋白酶和猪胰腺弹性蛋白酶的活性，对于开发丝氨酸蛋白酶抑制剂类药物具有重要的意义。3、本专利技术通过基于高通量转录组测序方法，以菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞为实验材料，通过基因注释，筛选其表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的EST序列标签，并通过RACE方法得到CvT-SPI的cDNA全长序列。得到CvT-SPI的cDNA核苷酸序列后，利用大肠杆菌表达系统进行诱导表达蛋白，利用His-tag能够在较短的时间内获得大量的可溶性CvT-SPI重组蛋白，为进行CvT-SPI的活性实验提供了便利。附图说明图1:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI的基因验证；图2:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核诱导表达和纯化的蛋白电泳图，其中1，没有加IPTG诱导结果；2，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导结果；3，纯化浓缩后的蛋白样品；M，蛋白Marker；图3：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI的基因序列和氨基酸序列分析，其中下划线标注CvT-SPI的信号肽序列；黑色加粗斜体表示多腺苷酸化信号；灰色阴影部分表示半光氨酸残基(Cysteine,C)；*表示终止密码子；图4:菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对胰蛋白酶的抑制效果；图5：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对弹性蛋白酶的抑制效果；图6：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对枯草杆菌蛋白酶A的抑制效果；图7：菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因原核表达获得的重组蛋白对寄主血淋巴PPO激活的影响；其中阴性对照是1μg/μlBSA,阳性对照是饱和的PTU,诱导剂为浓度0.1μg/μl的灭活藤黄微球菌Micrococcusluteus,空白是TBS缓冲液，浓度是0.01MTris-HCl(pH＝7.4)。具体实施方式本专利技术提供了一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，该基因的全长是696bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其中该基因开放阅读框(ORF)是480bp，编码160aa，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示的氨基酸组成的蛋白质或者本专利技术提供了一种与序列SEQIDNO.2限定的氨基酸序列同源性在95％～100％编码相同功能蛋白的氨基酸序列或者由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个氨基酸且具有同等活性的衍生蛋白。本专利技术提供了用于菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因体外重组表达的序列，是将所述蛋白氨基酸序列去除信号肽(1-22aa)前体后得到的，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术提供了菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因cDNA的克隆方法:以菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞总RNA反转录得到cDNA为模板，构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT‑SPI基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞丝氨酸蛋白酶抑制剂CvT-SPI基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.由权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列与SEQIDNO.2所示氨基酸序列具有95％～100％同源性，是由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过增加、缺失或者替换一个或者多个...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学新，谷启娟，时敏，黄健华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33