变形链球菌CAT‑SYI抗原及抗体制造技术

本发明专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种变形链球菌CAT‑SYI抗原及抗体。所述抗原由变形链球菌表面毒力蛋白抗原葡糖基转移酶GtfB和葡聚糖结合蛋白GbpB的功能区串联形成，所述抗体由该抗原制备得到。CAT‑SYI抗原由两个氨基酸片段(CAT和SYI)以及连接两个氨基酸片段的linker组成。将变形链球菌的毒力基因gtfB和gbpB经linker连接得到串联基因CAT‑SYI，首次制备得到CAT‑SYI抗原，由该抗原作为疫苗进行免疫，制备得到CAT‑SYI抗体。经动物实验发现所述CAT‑SYI抗体，与针对单个毒力基因以及全菌的抗体相比有更好的抗龋效果。证实CAT‑SYI抗原可作为基因工程龋齿疫苗的候选抗原,CAT‑SYI抗体可用于牙膏等日用品中或药物中以达到抗龋目的，具有良好的应用前景。

Streptococcus mutans CAT SYI antigen and antibody

The invention belongs to the field of biological pharmacy, in particular to a CAT of Streptococcus mutans SYI antigen and antibody. The antigen is formed by the functional region of Streptococcus mutans surface virulence protein antigen glucosyltransferase GtfB and dextran binding protein GbpB, and the antibody is prepared from the antigen. CAT SYI antigen by two amino acid fragments (CAT and SYI) and linker with two amino acid fragment composition. The Streptococcus mutans virulence genes gtfB and gbpB by linker gene CAT SYI series connection for the first time, CAT was prepared by SYI antigen, the antigen as a vaccine, prepared by CAT SYI antibody. The animal experiments showed that the CAT SYI antibody has better anti caries effect compared with the single virulence genes and antibody bacteria. CAT confirmed that SYI antigen can be used as a candidate antigen gene engineering vaccine of dental caries, CAT SYI antibody can be used in toothpaste and other daily necessities or drugs in order to achieve the purpose of anti caries, and has good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
变形链球菌CAT-SYI抗原及抗体
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及变形链球菌的CAT-SYI抗原及抗体。
技术介绍
龋病(dentalcaries)，俗称蛀牙，是由细菌代谢碳水化合物产酸，而引起牙齿脱矿化的的一种传染性疾病。由于牙釉质层和牙本质层的不可再生性，因而龋病不会自行愈合，如果不予治疗，龋病就会一直发生直到整颗牙齿被破坏。龋齿呈现黄色至黑色之间的颜色，患者会有疼痛并进食困难等症状，以及引发牙周炎、牙龈肿痛、牙龈出血、牙齿脱落等并发症。2017年JDentRes杂志报道全球的未接受口腔治疗的龋病患者数量由1990年的25亿人到2015年便上升至了35亿人，并且这个数目还将持续增长。在2010年，由全球口腔疾病引起的直接经济支出就有2980亿美元，大约占了全球卫生总支出的4.6％，再由世界卫生组织(WHO)和国家公共卫生研究所(PZH)的提供的数据显示，全球已有60％-90％的青少年遭受着龋病的影响。人类龋病的历史非常久远，早在16-65万年前就有了龋齿的痕迹，1900s人们才认识到龋病是由变链菌群和乳酸菌群类细菌引起的，但还不明确主要是哪一种细菌导致的，直到1924年才由Clarke首次分离并命名了龋病的主要致病菌“变形链球菌”。变形链球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)简称变链菌，被认为是引起龋病的主要致病菌之一，并且在口腔中其检出率高达74％-94％，变形链球菌为革兰氏阳性兼性微需氧菌，属于乳杆菌科-口腔链球菌属-变形链球菌菌群(mutanssteptococci)，变形链球菌群中包含远缘链球菌、猕猴链球菌、野鼠链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、道恩链球菌以及变形链球菌七个种。变形链球菌一共有c、e、f、k四种血清型，k型菌株是日本学者Nakana于2004年新发现的一种血清型，该血清型菌株在心内膜炎、菌血症以及动脉粥样硬化斑块患者血液中的检出率较高，此外，BaeJS等和NakaS等的研究发现k型菌株除了引起龋病外，还参与非酒精性脂肪肝的形成，并且黏连蛋白Cnm和SpaP参与该疾病的形成。在糖蛋白多糖组成上，c、e、f型菌株的多糖主链为鼠李糖，侧链为葡萄糖，k型菌株的多糖主链为鼠李糖，无侧链。在rgpF-ORF12基因上四种血清型基因序列有差异，因此可通过PCR法鉴定菌株的血清型。目前，c型是口腔中检出率最高的血清型，占70％-80％，其次是e型，占20％，而f型和k型在口腔中的检出率最低，比例<2-5％。虽然k型在口腔中的比例很低，最近几年有文献报道非c型的比例有上升趋势。变形链球菌的三大致病因子是形成生物膜、产酸和耐酸，其致龋过程由三个阶段组成，第一阶段是菌株“定植”于牙表面，该定植初期是由非蔗糖依赖型黏附蛋白SpaP介导的；第二阶段是细菌的“聚集”，这个阶段是由SpaP、Gtfs和Gbps介导的，Gtfs水解多糖为单糖，再分别催化α-1,3糖苷键和α-1,6糖苷键聚合成水溶性和水不溶性的葡聚糖；第三阶段是“生物膜的形成”，该阶段中大量葡聚糖与SpaP、Gbps、Gtfs等蛋白发生结合，相互作用下细菌大量聚集，在牙齿表面形成一层产酸的生物膜，即牙菌斑。以变形链球菌群为主的细菌代谢口腔中的糖类大量产酸，引起牙釉质层“脱矿化”与“再矿化过程”的失衡(Ca10(PO4)6(OH)2+14H+→10Ca2++6H2PO4－+H2O)，当牙表面微环境pH值<5.4就会使得牙釉质层脱矿化，最终龋齿形成。由于变形链球菌具有较其他口腔细菌更强的产酸和耐酸能力，因而更能适应pH值较低的酸性环境，是其更易成为口腔中主要的致龋菌。对于龋齿的治疗主要通过“阻止脱矿化过程-针对致病菌”和“促进再矿化过程”这两方面进行。“阻止脱矿化过程-针对致病菌”的方式有以下几种：化学药物类如青霉素、万古霉素、氯已定、SDS、三氯生等；天然药物类如茶树油、绿茶、蜂蜜等；抗菌肽：对广谱细菌种类(包括耐药菌株)具有强烈的杀伤作用；糖替代品类如木糖醇、山梨醇可添加至口香糖用于防龋；以及本专利技术所涉及的免疫防龋。免疫防龋包括“主动免疫防龋”和“被动免疫防龋”两方面，“主动免疫防龋”是指将灭活变形链球菌、表面抗原蛋白、多肽片段、DNA等制成可以使机体产生特异性免疫反应的生物制品，从而使机体获得免疫保护。目前变形链球菌的表面蛋白如黏附蛋白SpaP、葡聚糖结合蛋白Gbps、葡糖基转移酶Gtfs这三大类已被证实能够激起机体的粘膜免疫应答并产生特异性IgA。“被动免疫防龋”是指通过向牛或鸡注射抗原，再从牛奶、蛋黄中获得特异性抗体，再将抗体直接用于龋病治疗的一种新途径。通过被动免疫治疗可使机体立即获得特异性抗体，并且直接靶向于目标抗原。已经有较多关于免疫防龋的文献报道其作用。SpaP的A区包含唾液蛋白结合区(SBR)，HajishengallisG等通过大肠杆菌原核表达SBR功能区域，制备抗原并免疫大鼠，在大鼠体内激起了T细胞的免疫应答，并产生了特异性抗体，在动物体内获得了免疫抑龋的保护作用。2014年BatistaMT等分别通过大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达SpaP39-512抗原蛋白，制备抗原免疫大鼠，有效抑制了大鼠口腔中变形链球菌的定植。2008年R.D.Nogueira等通过黏膜免疫SD大鼠GtfB的CAT和GLU片段，激起了黏膜免疫应答并产生了特异性IgA抗体，获得了免疫抑龋的效果。2012年KimMA等原核表达GtfB的N段抗原(gtfB193-1530)，免疫BALB/c小鼠，从脾脏细胞分离出的产特异性抗体的细胞并与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出分泌抗GtfB抗体的单克隆杂交瘤细胞。制备出的单克隆抗体在体外实验中能够有效抑制GtfB的酶活性。2001年Smith通过阴离子交换层析从变形链球菌的培养上清液中纯化GbpB蛋白，制得的特异性卵黄抗体饲喂SD大鼠取得了较好的抑龋效果。国内学者杨德琴等通过体外PCR扩增变形链球菌的spaP和gtfB基因，并构建pcDNA3-spaP和pcDNA3-gtfB核酸疫苗免疫大鼠，结果表明混合疫苗取得了与全菌疫苗相同的抑龋效果。2013年LiHuang等将spaP基因(A区和P区功能区)与gtfB基因的GLU功能区串联，构建真核质粒，并制备DNA疫苗PGJA-P/VAX，免疫Wistar大鼠，该DNA疫苗在Wistar大鼠体内激起黏膜免疫应答，体外实验表明，大鼠唾液中分泌的IgA能抑制变形链球菌在唾液包被羟基磷灰石上的黏附。专利CN102488898A公开了一种用于由变形链球菌感染所造成的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包括从变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。并且提供制备疫苗组合物的方法。专利CN102973939A公开了一种抗变形链球菌和远缘链球菌混合特异性IgY抗体制剂，其特征在于，由10～70重量份的变形链球菌菌体和菌体碎片与30～90重量份的远缘链球菌菌体和菌体碎片混合成抗原免疫产蛋母鸡而制备。该专利技术用于预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭的牙膏对预防龋齿、牙龈炎和牙周炎及其口臭病菌具有明显的效果。目前，用于预防龋齿的疫苗多是特异性针对单个变形链球菌毒力基因或者针对全菌，而特异性针对两个或以上毒力基因的功能区域本文档来自技高网...

【技术保护点】
CAT‑SYI抗原，其特征在于，所述CAT‑SYI抗原由两个氨基酸片段连接而成，氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.CAT-SYI抗原，其特征在于，所述CAT-SYI抗原由两个氨基酸片段连接而成，氨基酸序列分别为：SEQIDNO:1，SEQIDNO:2。2.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述两个氨基酸片段的linker氨基酸序列为：SEQIDNO:3。3.由权利要求1所述的抗原制备的抗体。4.权利要求1所述的抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①设计引物：选择GenBank上公布的变形链球菌标准菌株UA159(AE014133.2)基因组DNA为模版，设计CAT区域和SYI区域的引物，在CAT引物的R链加上linker的碱基序列，SYI引物的F链加上linker的碱基序列；②SOE-PCR扩增串联基因CAT-SYI：降落PCR分别扩增CAT和SYI，产物纯化后...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈咏梅，李再新，李兴玲，
申请(专利权)人：四川理工学院，
类型：发明
国别省市：四川,51