一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术提供了一系列酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体。

A malt oligosaccharide trehalose synthase mutant and its application

The invention discloses a malt oligosaccharide trehalose synthetase mutant and its application, which belongs to the field of genetic engineering and enzyme engineering. The present invention provides a series of mutants of malt oligosaccharide - based trehalose synthase with increased enzyme activity.

【技术实现步骤摘要】
一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程

技术介绍
海藻糖(Trehalose)由两个吡喃葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是一种稳定的非还原性寡糖，同时具有高度安全性和有良好的稳定性，被广泛应用于医药、食品、化妆和农业等领域。自1995年以来，日本、美国和欧盟等先后批准海藻糖可以用作食品添加剂。2005年，我国卫生部正式批准海藻糖为新资源食品。1993年日本林原生化研究所首次发现麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以液化淀粉作为底物，这两种酶协同作用，可以生成海藻糖，并且率先实现了海藻糖工业化生产。目前，我国已有公司开始生产海藻糖，但产品性能、产率与进口产品存在一定差距，并且生产成本一直居高不下。更为严峻的是，为了迎合市场需求，海藻糖售价不断下降，给海藻糖生产带来了巨大挑战和压力。因此如何提升海藻糖产率，实现海藻糖低成本规模化制备，使其走向大众消费者的餐桌成为学术界和产业界关注的热点。目前，工业化生产海藻糖主要通过两种方法：①利用海藻糖合成酶，以麦芽糖作为底物，通过分子内转糖基作用，生成海藻糖；②以淀粉液化液作为底物，经麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖。两种方法海藻糖产率均为80％左右。但是，从生产成本以及周期考虑，以淀粉作为底物制备海藻糖，工艺更为简便，成本跟为低廉。因此，麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)协同作用生产海藻糖，更具优势。国内外双酶法生产海藻糖包括中低温酶系(海藻糖转化率：Arthrobactersp.Q36：80％、ArthrobacterramosusS34：66％，Brevibateriumhelvolum：70.4％)和高温酶系(SulfolobussolfataricusKM1：81.5％、SulfolohusacidocaldariusATCC33909：80.2％)。高温酶系通常具有较高的海藻糖转化率，并且具有良好的热稳定性，能在较高温度下转化淀粉生成海藻糖，不容易在生产过程中污染杂菌。但是，高温酶系相对于中低温酶系，具有蛋白表达量低，比酶活低的缺点，不利于其工业化应用。
技术实现思路
基于上述现状，本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活，为其工业化生产创造条件。本专利技术提供了具有酶活提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，酶活提高。在本专利技术的一种实施方式中，所述嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为G81S。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第263位置的谷氨酸(Glu)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为E263G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，突变体命名为F284V。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为G432D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，突变体命名为T439A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第583位置的苯丙氨酸(Phe)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为F583L。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第585位置的谷氨酰胺(Gln)变成精氨酸(Arg)，突变体命名为Q585R。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为G586D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第611位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，突变体命名为I611T。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第615位置的丝氨酸(Ser)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为S615G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，同时将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，得到F284V/T439A。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到F284V/G586D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到T439A/G586D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第585位置的谷氨酰胺(Gln)变成精氨酸(Arg)，得到T439A/Q585R。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到G432D/G586D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)、将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)、将第615位置的丝氨酸(Ser)变成甘氨酸(Gly)，得到G81S/F284V/S615G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)、将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)、将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到F284V/T439A/G586D。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)、将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)、将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)、将第615位置的丝氨酸(Ser)变成甘氨酸(Gly)，得到G81S/F284V/T439A/S615G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)、将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)、将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到将第615位置的丝氨酸(Ser)变成甘氨酸(Gly)G81S/F284V/G586D/S615G。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将第263位置的谷氨酸(Glu)变成甘氨酸(Gly)、将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)、将第583位置的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，包含了将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第81、263、284、432、439、583、585、586、611或615位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体。2.根据权利要求1所述的一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，所述突变体是将第81位置的甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为G81S；或，所述突变体是将第263位置的谷氨酸(Glu)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为E263G；或，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，突变体命名为F284V；或，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为G432D；或，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，突变体命名为T439A；或，所述突变体是将第583位置的苯丙氨酸(Phe)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为F583L；或，所述突变体是将第585位置的谷氨酰胺(Gln)变成精氨酸(Arg)，突变体命名为Q585R；或，所述突变体是将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，突变体命名为G586D；或，所述突变体是将第611位置的异亮氨酸(Ile)变成苏氨酸(Thr)，突变体命名为I611T；或，所述突变体是将第615位置的丝氨酸(Ser)变成甘氨酸(Gly)，突变体命名为S615G；或，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，同时将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，得到F284V/T439A；或，所述突变体是将第284位置的苯丙氨酸(Phe)变成缬氨酸(Val)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到F284V/G586D；或，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，得到T439A/G586D；或，所述突变体是将第439位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第585位置的谷氨酰胺(Gln)变成精氨酸(Arg)，得到T439A/Q585R；或，所述突变体是将第432位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨酸(Asp)，同时将第586位置的甘氨酸(Gly)变成天冬氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，姚锴琳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32