一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用制造技术

本发明专利技术筛选出了一株高产γ‑氨基丁酸副短乳酸杆菌（Lactobacillus parabrevis）HX12‑19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCM2017307。本发明专利技术副短乳杆菌HX12‑19从食品材料中分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物γ‑氨基丁酸，大大提高生产效率，降低成本，发酵产率可达235 g/L，具备生产竞争力；产品采用结晶方式进行精制，纯度可达98%，适用于工业化生产。

A strain of high gamma aminobutyric acid lactic acid bacteria and its application

The present invention screened a strain of high gamma aminobutyric acid Lactobacillus (short side

【技术实现步骤摘要】
一株高产γ-氨基丁酸的乳酸菌及其应用
本专利技术涉及一株乳酸菌及该菌种在生产γ-氨基丁酸方面的应用，属于微生物发酵工程领域。
技术介绍
γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyricacid，简称GABA），广泛分布于原核和真核生物中。2009年9月，我国卫生部批准γ-氨基丁酸为新资源食品。GABA具有抗高血压、促睡眠、增进脑机能及肝功能等功能，在化妆品中还可以起到抗皱、美白、保湿等功效。GABA在国外广泛应用于化妆品、药品、保健品、食品中。随着近年来欧、美等发达国家在原料上提出了以绿色健康为主题的开发倾向，含有安全性高的功能因子GABA的食品和化妆品会更加的受到消费者的欢迎。GABA的天然含量很低，单纯依靠天然物质的提取远远满足不了市场的需求。同化学合成法和自然富集法相比，微生物发酵法不受空间、环境、资源的限制，具有成本低、无化学残留、产量高等显著优点，是生产GABA的理想途径。目前发酵法生产的GABA产品以20-90%居多，且产品多成黄色，有气味，纯度高的产品分离纯化复杂，成本较高。随着GABA逐渐被国内消费者认知，应用安全菌生产天然原料GABA，绿色安全，符合消费者的需求。而市场上发酵法生产的高纯度的GABA产品成本较高，不能满足未来市场需求，因此，筛选高产菌种，改进生产工艺是当务之急。
技术实现思路
为解决发酵产率低、分离纯化难的问题，本专利技术提供了一株从自然界中筛选的乳酸菌及利用该菌种发酵生产高纯度GABA的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一株副短乳杆菌(Lactobacillusparabrevis)HX12-19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国武汉，保藏编号为：CCTCCM2017307，保藏日期为2017年6月6日。所述菌株的16srRNA序列为SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。一种上述副短乳杆菌的发酵培养基，包括以下组分：蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉8.0-12.0g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）8.0-12.0g/L，葡萄糖8.0-12.0g/L，吐温800.5-1.5mL/L，乙酸钠4.0-6.0g/L，磷酸氢二钾1.5-2.5g/L，硫酸镁0.4-0.8g/L，硫酸锰0.2-0.4g/L。一种发酵法制备高纯度γ-氨基丁酸的方法，采用以下步骤：（1）种子液制备：将副短乳杆菌HX12-19接入种子培养基，摇瓶发酵至一定菌体密度，获得种子液；（2）发酵：将种子液接入发酵罐培养基，通气搅拌培养，当菌体达一定密度时，结束发酵，获得发酵液；（3）转化：离心收集菌体，进行转化反应，间断添加底物并调节pH值，获得转化液；（4）脱色：升温并保持一段时间，快速降温后添加活性炭，吸附、过滤；（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，分离固液，用乙醇洗涤固体；（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品。所述步骤（1）的液体培养基为副短乳杆菌发酵培养基，pH值为4-6；发酵时间为7-9h，菌体密度为OD600＞0.8。所述步骤（2）的液体培养基为副短乳杆菌发酵培养基，培养期间用磷酸调控pH值为4-6；培养温度为30±2℃；培养时间为18-22h；菌体密度为OD600＞2.7。所述步骤（3）中，底物为L-谷氨酸或谷氨酸钠；用磷酸调控pH值为4-6；转化温度为30±2℃。所述步骤（4）快速升温至70-90℃，保持0.5-2h，快速降温至60-65℃，活性炭添加量为0.5-1%（w/v）；吸附时间为1-3h。所述步骤（5）结晶所采用的方式是真空蒸发结晶，蒸发温度为50-90℃；乙醇浓度为90%-100%（v/v）。所述步骤（6）真空干燥的温度为小于60℃；干燥至失重小于2%；所述γ-氨基丁酸产品，纯度大于98%。一种上述副短乳杆菌HX12-19在生产高纯度γ-氨基丁酸中的应用。本专利技术具有以下优点：本专利技术的乳酸菌菌株HX12-19从食品材料上分离筛选获得，安全性高，可用于食品等领域；菌株发酵产率高，具备生产竞争力，可适用于工业化大生产；本专利技术利用乳酸菌菌株HX12-19采用传统发酵和生物转化分段控制，充分利用生物酶转化得到产物GABA，大大提高生产效率，降低成本；产物采用结晶方式进行精制，可得到高纯度的产品。附图说明图1为菌株HX12-19的16SrDNA系统发育树。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1菌株的分离纯化与鉴定富集培养：分别取少量新鲜蔬菜、自制酸菜、蔬菜地土样、购买的酸菜、新鲜牛奶等样品加入含有味精（谷氨酸钠≥95%）的乳酸菌培养基（MRS培养基，成分g/L：蛋白胨10.0，牛肉浸粉4.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0）中，30℃静止培养2天。定性检测：纸层析法（或薄层层析法），将经过稀释处理的发酵液点样到定性滤纸（或硅胶预制板）上，用层析液展开。层析液采用正丁醇：冰醋酸：水（60:15:25），添加0.4%的茚三酮。展开结束后自然晾干，85ºC显色10min，分别对培养两天后的富集液进行稀释、定性检测，与标样比较。分离单菌落：对有GABA生成的富集液，先进行镜检，判断细菌种类，进而稀释涂布，涂布平板培养基为含有10g/LCaCO3的MRS固体培养基（成分g/L：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-801.0，琼脂15.0），30℃培养2天，挑取若干有溶钙圈的疑似乳酸菌（湿润光滑，边缘整齐，小圆）的菌落，接种含味精（谷氨酸钠≥95%）的培养基中，30℃，静止2天，定性检测并比较GABA产量大小。采集自酸菜的菌种HX12-19GABA最高，菌体形态为短杆状，革兰氏染色显阳性，16srRNA基因序列如SEQIDNO:1所示，根据MEGA5.0软件构件系统发育树见图1，与GenBank中副短乳杆菌（Lactobacillusparabrevis）的同源性为97%。实施例2制备高纯度γ-氨基丁酸（1）种子液制备：将HX12-19菌种接入培养基，摇瓶发酵，获得种子液；（2）发酵：将培养9h，OD600＞0.8的种子液接入10L发酵罐中的液体培养基（10L），培养基成分为：蛋白胨10.0g/L，酵母粉10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，吐温801.0mL/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，味精（谷氨酸钠≥95%）10.0g/L。通气搅拌培养当培养18h，OD600=2.9，结束发酵，获得发酵液；（3）转化：离心收集菌体，加纯化水至5L左右，添加谷氨酸钠，温度控制为30±2℃，开启搅拌，进行反应。反应期间随着pH值得不断升高，间断添加磷酸和谷氨酸钠，将pH值控制在4.0-6.0间，当pH值变化率小于0.1/h时停止反应，取样测定γ-氨基丁酸浓度，根据体积计算总量M1。（4）脱色：将转化液快速加热至90℃，蛋白质变性1h后，快速降温至65℃，添加1%活性炭，吸附1h后过滤。（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，控制结晶的温度在55℃-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株副短乳杆菌（

【技术特征摘要】
1.一株副短乳杆菌（Lactobacillusparabrevis）HX12-19，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCCM2017307。2.一种如权利要求1所述的副短乳杆菌HX12-19在生产高纯度γ-氨基丁酸中的应用。3.一种发酵法制备高纯度γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，采用以下步骤：（1）种子液制备：将副短乳杆菌HX12-19接入种子培养基，摇瓶发酵至一定菌体密度，获得种子液；（2）发酵：将种子液接入发酵罐培养基中，通气搅拌培养，当菌体达一定密度时，结束发酵，获得发酵液；（3）转化：离心收集菌体，进行转化反应，间断添加底物并调节pH值，获得转化液；（4）脱色：升温并保持一段时间，快速降温后添加活性炭，吸附、过滤；（5）结晶：蒸发结晶获得结晶液，分离固液，用乙醇洗涤固体；（6）干燥：将洗涤后的固体进行真空干燥得γ-氨基丁酸产品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）的发酵时间为7-9h，菌体密度为OD600＞0.8。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）培养期间用磷酸调控pH值为4-6；培养温度为30±2℃；培养时间为18-22h；菌体密度...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天萌，陆震，孙劭靖，郭文逸，石艳丽，郭学平，栾贻宏，
申请(专利权)人：华熙福瑞达生物医药有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37