突变型转氨酶及与其相关的方法和用途技术

本发明专利技术涉及相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶、包含该转氨酶的融合蛋白、编码该转氨酶的多核苷酸、包含该多核苷酸、突变型转氨酶和/或融合蛋白的宿主细胞，用该突变型转氨酶或融合蛋白生产胺的方法、以及该突变型转氨酶或融合蛋白用于生产胺的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变型转氨酶及与其相关的方法和用途
本专利技术涉及相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶、包含该转氨酶的融合蛋白、编码该转氨酶的多核苷酸、包含该多核苷酸、突变型转氨酶和/或融合蛋白的宿主细胞、用该突变型转氨酶或融合蛋白生产胺的方法、以及该突变型转氨酶或融合蛋白用于生产胺的用途。
技术介绍
转氨酶(也称为氨基转移酶)催化氨基转移反应，即将氨基从胺供体转移到胺受体，特别是酮的胺化以及胺的脱氨基，其中一个分子或结构域上的NH2基团与另一分子或结构域上的＝O基团交换(参见方案1)。胺化合物如手性胺是药学、农业化学或化学工业的重要组成基石。在许多这些应用中，非常重要是使用仅一种光学纯形式。化学合成已被建立起来用于生产这类化合物(例如使用过渡金属的非对称氢化)，但是这些化学方法在产率、纯度和废物产生方面远远是不完美的。转氨酶催化的胺生产常是经典方法的有利替代方案，因此替代的或改进的转氨酶在该领域是有意义的。如在使用工程化的(R)选择性转氨酶生产药物西格列汀(sitagliptin)中被很好展示的(Savile等人，2010；US2015/0037869)，通过酶介导的转氨作用生产手性胺与已建立的化学非对称合成相比是有利的。在这种情况下，通过定向进化方法全面地工程化改造了最初对所需底物无活性的胺转氨酶(ATA)。转氨酶的进一步突变在本领域中描述(Steffen-Munsberg等人，2013；Nobili等人，2015Deszcz等人，2015)。还可以使用其它酶来生产光学纯的手性胺和氨基酸，如单胺氧化酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶、解氨酶或氨基变位酶。尽管转氨酶可用于外消旋胺的动力学拆分，但从酮酸、酮或醛的非对称合成是非常重要的，因为它们可能潜在地导致理论上100％的转化，而动力学拆分模式中仅为50％的理论产率(参见方案1，图解合成以及动力学拆分)。方案1：残基Ra、Rb、Rc和Rd仅用于举例说明目的，应代表一般的有机残基。然而，定向进化方法并不能使我们洞悉分子原因(例如关于较大体积底物的接受性)。转氨酶的高对映选择性推动了大、小结合口袋理论，然而，扩大小结合口袋以适应大体积的底物是不容易实现的目标，如以下事实所证明：迄今为止在文献中发现的大多数成功实例是转化甲基酮类化合物的转氨酶。本专利技术的目的是设计相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶。优选地，它们应该能够接受宽范围的底物，特别是大体积的底物，特别是同时保持立体选择性，以及使用异丙胺作为供体。因此，增加的活性特别地与大体积的底物(一个例示的选择在方案2和3中描述，见下文)以及胺供体异丙胺相关。这些立体选择性转氨酶可用于从相应的酮非对称合成手性胺以及用于动力学拆分。专利技术概述令人惊奇的是，已经发现，一种突变型转氨酶相对于野生型转氨酶显示出增加的转氨酶活性，所述突变型转氨酶包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属(Ruegeriasp.)TM1040转氨酶；称为3FCR)至少65％相同的氨基酸序列，并且相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代，其中对应于SEQIDNO：1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59)，以及对应于SEQIDNO：1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly231)。如实施例所示，已经鉴定到转氨酶中的几个氨基酸残基，其取代增加突变型转氨酶相对于相应的野生型转氨酶的转氨酶活性。特别地，可证明，3FCR的双突变体(即，在SEQIDNO：1的位置59处Tyr被Trp取代(Y59W)和位置231处Thr被Ala取代(T231A)的3FCR(称为Y59W/T231A))，对野生型接受的底物具有增加的活性(方案2中所示的胺3a和4a)，并且还对胺1a测定到低活性(参见表3和4)。用转氨酶3FCR的突变体获得的结果可以通过百脉根中间根瘤菌maff303099(Mesorhizobiumlotimaff303099)的转氨酶(简称为3GJU)的突变体证实(参见表3)。此外，在SEQIDNO：1的位置87处Tyr被Phe额外取代和/或位置152处Tyr被Phe额外取代的3FCR突变体(称为Y87F和Y152F)，对带有两个芳香环的底物(即胺1a、3a和4a)具有增加的活性(参见表4中Y59W/Y87F/T231A和Y59W/Y87F/Y152F/T231A)。同时突变Y152F显着增加突变体的稳定性(图1)。在3FCR的转氨酶中进一步用His取代SEQIDNO：1的位置423处的Pro(称为P423H)，可以获得活性和接受的底物范围的甚至更进一步增加(参见表3和4)。可证明，具有取代Y59W、Y87F、Y152F、T231A和P423H的突变体对大体积的底物(例如胺1a、3a和4a)特别有活性。再次，用转氨酶3FCR的突变体获得的结果可以用3GJU的突变体证实(参见表3)。此外，具有突变Y59W/Y87F/Y152F/T231A的ATA-3、ATA-5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9的突变型转氨酶被证实，对胺1a、3a、4a和6a具有活性(见表5)。请注意，野生型序列ATA-3至ATA-9与野生型3FCR具有从65-70％至约90％的序列同一性。因此，可以得出结论，本专利技术的概念可以应用于与3FCR的序列(SEQIDNO：1)具有65％或更高的序列同一性的所有转氨酶。另外，发现在位置87具有脂肪族疏水性氨基酸如Leu或Val(分别为Y87L或Y87V)的3FCR和3GJU突变体具有增加的活性，并且对于接受叔碳取代基(如胺2a)特别有效(参见表6)。在位置59处具有苯丙氨酸(Y59F)和/或在位置231处具有甘氨酸(T231G)的突变体显示出对双环化合物(如胺5a)增加的活性(参见表7)。此外，在位置234处Ile被Phe或Met取代的3FCR突变体(分别称为I234F和I234M)对胺5a(参见表7)和胺供体异丙胺(参见表8)具有增加的活性。在实施例5至11中证实了突变体在非对称合成和动力学拆分中维持立体选择性和适用性(见表9至10)。因此，在第一方面，本专利技术提供了相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶，其中突变型转氨酶包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属TM1040转氨酶；称为3FCR)至少65％相同的氨基酸序列，其中突变型转氨酶相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代，其中对应于SEQIDNO：1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59)，并且对应于SEQIDNO：1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly231)。
技术实现思路
术语“转氨酶”(由生物化学国际联合会的酶学委员会(EnzymeCommissionoftheInternationalUnionofBiochemistry)分类为EC2.6.1.XX；也称为氨基转移酶)通常是指，催化胺基团从胺供体转移到胺受体的羰基上(转氨作用)的酶。转氨酶是5'-磷酸吡哆醛依赖(PLP依赖)的酶。如方案1所示，胺供体向胺受体提供氨基，以便合成所需的胺，并形成相应的酮。由于转氨酶通常具有高的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶，其中所述突变型转氨酶包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属TM1040转氨酶；称为3FCR)至少65％相同的氨基酸序列，其中突变型转氨酶相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代，其中对应于SEQ ID NO：1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59)，并且对应于SEQ ID NO：1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly 231)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.16 EP 15001113.81.一种相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶，其中所述突变型转氨酶包含与SEQIDNO：1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属TM1040转氨酶；称为3FCR)至少65％相同的氨基酸序列，其中突变型转氨酶相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代，其中对应于SEQIDNO：1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59)，并且对应于SEQIDNO：1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly231)。2.根据权利要求1所述的突变型转氨酶，-其中在对应于SEQIDNO：1的位置87的位置处的氨基酸被疏水性氨基酸(HYaa87)取代，特别地其中疏水性氨基酸是Leu(Leu87)或Val(Val87)或Phe(Phe87)；和/或-其中在对应于SEQIDNO：1的位置152的位置处的氨基酸被Phe(Phe152)取代，和/或-其中在对应于SEQIDNO：1的位置234的位置处的氨基酸被Phe(Phe234)或Met(M234)取代，和/或-其中在对应于SEQIDNO：1的位置423的位置处的氨基酸被His(His423)取代。3.根据权利要求1或2所述的突变型转氨酶，其中所述转氨酶至少具有突变-Trp59和Ala231,或-Trp59,Phe87和Ala231；或-Trp59,Leu87和Ala231；或-Trp59,Val87和Ala231；或-Trp59,Phe87,Ala231和His423；或-Trp59,Phe87,Phe152和Ala231；或-Trp59,Leu87,Phe152和Ala231；或-Trp59,Val87,Phe152和Ala231；或-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和His423,或-Trp59和Gly231；或-Trp59,Phe87和Gly231；或-Trp59,Leu87和Gly231；或-Trp59,Val87和Gly231；或-Trp59,Phe87,Phe152和Gly231；或-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和His423；或-Phe59和Ala231；或-Phe59,Phe87和Gly231；或-Trp59,Ala231和Phe234；或-Trp59,Ala231和Met234；或-Trp59,Phe87,Ala231和Phe234；或-Trp59,Leu87,Ala231和Phe234；或-Trp59,Val87,Ala231和Phe234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Phe234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Phe234和His423,或-Trp59,Gly231和Phe234；或-Trp59,Phe87,Gly231和Phe234；或-Trp59,Leu87,Gly231和Phe234；或-Trp59,Val87,Gly231和Phe234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Phe234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Phe234和His423；或-Phe59,Phe87,Gly231和Phe234,或-Trp59,Ala231和Met234；或-Trp59,Phe87,Ala231和Met234；或-Trp59,Leu87,Ala231和Met234；或-Trp59,Val87,Ala231和Met234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Met234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Met234和His423,或-Trp59,Gly231和Met234；或-Trp59,Phe87,Gly231和Met234；或-Trp59,Leu87,Gly231和Met234；或-Trp59,Val87,Gly231和Met234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Met234；或-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Met234和...

【专利技术属性】
技术研发人员：U·博恩朔伊尔，S·P·汉隆，H·伊丁，I·帕夫利季斯，P·斯普尔，M·斯蒂芬韦斯，B·沃兹，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH