活性人源AGR2的制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种活性人源前梯度蛋白AGR2的制备方法，包括如下步骤：（1）将人源AGR2基因插入载体，获得AGR2重组表达载体；（2）将步骤（1）所得AGR2重组表达载体转化宿主细胞，得到转化子；（3）培养步骤（2）所述转化子并处理培养后的转化子，得到活性人源AGR2。

【技术实现步骤摘要】
活性人源AGR2的制备方法和试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种活性人源AGR2的制备方法和试剂盒。
技术介绍
非洲爪蟾的前梯度蛋白XAG-1、XAG-2和XAG-3最早发现于非洲爪蟾胚胎切片。随着胚胎年龄增长，XAG-2在胚胎背部外胚层前部区域的表达量增加，该区域与粘液腺的发育有关。前梯度蛋白2(Anteriorgradientprotein2，AGR2)是一种在人体中由AGR2基因表达的蛋白，其是XAG-2在人体内的同源物。AGR2在分泌粘液的组织和内分泌器官包括肺、胃、结肠、前列腺和小肠中有高表达量。AGR2的表达受到雄激素和雌激素的调节。AGR2蛋白是一种蛋白二硫键异构酶，在蛋白折叠中起重要作用。AGR2具有可进行氧化还原反应的CXXS活性结构域序列，在底物(如肠黏蛋白)中形成二硫化物。AGR2通过硫氧还原蛋白样结构域与黏蛋白2相互作用，与黏蛋白2的半胱氨酸残基间形成异二硫键。AGR2的C端具有与KDEL和KVEL序列相似的KTEL的结构域，与内质网保留有关。人源AGR2最早发现于雌激素受体阳性乳腺癌细胞。后来的研究显示AGR2在食管腺癌，胰腺癌和前列腺癌中都存在过表达。在人体内AGR2蛋白的高表达会引起肿瘤抑制蛋白p53下调、血管内皮生长因子VEGF和纤维母细胞生长因子FGF2活性增强，促进血管生成和成纤维细胞协调肿瘤细胞侵袭，与肿瘤细胞形成和迁移有关。获得具有活性的人源AGR2蛋白对于进一步研究其生物学功能及临床应用具有重要的理论和实际意义。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种活性人源AGR2的制备方法和试剂盒，以制备具有活性的人源AGR2，从而可以进一步研究人源AGR2的生物学功能和临床应用。本专利技术提供了一种活性人源前梯度蛋白AGR2的制备方法，包括如下步骤：(1)将人源AGR2基因插入载体，获得AGR2重组表达载体；(2)将步骤(1)所得AGR2重组表达载体转化宿主细胞，得到转化子；(3)培养步骤(2)所得转化子并处理培养后的转化子，得到活性人源AGR2。于本专利技术的一个实施例中，所述人源AGR2基因的序列如SEQIDNO：5所示。于本专利技术的一个实施例中，所述人源AGR2基因可通过包括如下步骤的方法获得：从人乳腺癌细胞MCF7提取总RNA；制备所述总RNA对应的cDNA；以所述cDNA为模板进行AGR2基因特异性PCR扩增，获取人源AGR2基因；其中，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，具体为5’-GGATCCATGGAGAAAATTCCAGTGTC-3’，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物包括酶切位点；所述AGR2基因特异性PCR的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，具体为5’-TTACAATTCAGTCTTCAGCA-3’。于本专利技术的一个实施例中，所述步骤(1)中的载体为原核表达载体pMAL-c2。于本专利技术的一个实施例中，所述步骤(1)包括：将人源AGR2基因和所述原核表达载体pMAL-c2酶切、连接，得到重组表达载体pMAL-AGR2-MBP；通过突变PCR在所述pMAL-AGR2-MBP中删除MBP基因并插入His标签基因，得到AGR2重组表达载体。于本专利技术的一个实施例中，所述突变PCR的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，具体为5’-CACCACCACAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAGCCA-3’；所述突变PCR的下游引物序列如SEQIDNO：4所示，具体为5’-GTGGTGGTGCATAATCTATGGTCCTTGTTGGTGAAGTGC-3’。于本专利技术的一个实施例中，所述步骤(3)包括：通过镍层析柱对所述活性人源AGR2进行纯化。本专利技术还提供了一种活性人源前梯度蛋白AGR2的制备试剂盒，包括：用于获取人源AGR2基因的试剂、载体、用于构建AGR2重组表达载体的试剂、转化试剂。于本专利技术的一个实施例中，所述用于获取人源AGR2基因的试剂包括总RNA提取试剂、反转录试剂、AGR2基因特异性PCR的上游引物和AGR2基因特异性PCR的下游引物；其中，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，具体为5’-GGATCCATGGAGAAAATTCCAGTGTC-3’，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物包括酶切位点，所述AGR2基因特异性PCR的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，具体为5’-TTACAATTCAGTCTTCAGCA-3’。于本专利技术的一个实施例中，所述载体为原核表达载体pMAL-c2。于本专利技术的一个实施例中，所述用于构建AGR2重组表达载体的试剂包括用于将人源AGR2基因和所述原核表达载体pMAL-c2酶切和连接的试剂、突变PCR的上游引物和突变PCR的下游引物。于本专利技术的一个实施例中，所述突变PCR的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，具体为5’-CACCACCACAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAGCCA-3’；所述突变PCR的下游引物序列如SEQIDNO：4所示，具体为5’-GTGGTGGTGCATAATCTATGGTCCTTGTTGGTGAAGTGC-3’。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：可以简便、高效地获得具有活性的人源AGR2，有利于对人源AGR2进行生物学功能和临床应用研究。附图说明图1为本专利技术实施例提供的pMAL-his-AGR2的构建流程图；图2为人源AGR2基因的特异性PCR图谱。泳道21为DS5000分子量标准(自上向下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道为22特异性PCR产物的电泳结果。图3为人源AGR2基因的特异性PCR片段和pMAL-c2载体酶切与连接鉴定图谱。泳道为31DS5000分子量标准(自上向下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道32为T4连接酶连接产物的电泳结果，泳道33为载体BamHI酶切产物的电泳结果，泳道34为特异性PCR片段BamHI酶切产物的电泳结果。图4为重组质粒pMAL-his-AGR2酶切鉴定图谱。泳道41为DS5000分子量标准(自上向下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道42为未酶切的质粒pMAL-his-AGR2的电泳结果，泳道43为BamHI酶切后的pMAL-his-AGR2的电泳结果，泳道44为Xbal酶切后的pMAL-his-AGR2的电泳结果。图5为突变产物鉴定图谱。泳道51为DS5000分子量标准(自上向下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)，泳道52为突变产物的电泳结果，泳道53为pMAL-MBP-AGR2的电泳结果。图6为人源AGR2重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定结果。泳道61为蛋白分子量标准(自上向下依次为180kDa，130kDa，100kDa，70kDa，55k本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性人源前梯度蛋白AGR2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人源AGR2基因插入载体，获得AGR2重组表达载体；(2)将步骤(1)所得AGR2重组表达载体转化宿主细胞，得到转化子；(3)培养步骤(2)所得转化子并处理培养后的转化子，得到活性人源AGR2。

【技术特征摘要】
1.一种活性人源前梯度蛋白AGR2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将人源AGR2基因插入载体，获得AGR2重组表达载体；(2)将步骤(1)所得AGR2重组表达载体转化宿主细胞，得到转化子；(3)培养步骤(2)所得转化子并处理培养后的转化子，得到活性人源AGR2。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人源AGR2基因的序列如SEQIDNO：5所示。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人源AGR2基因可通过包括如下步骤的方法获得：从人乳腺癌细胞MCF7提取总RNA；制备所述总RNA对应的cDNA；以所述cDNA为模板进行AGR2基因特异性PCR扩增，获取人源AGR2基因；其中，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物序列如SEQIDNO：1所示，具体为5’-GGATCCATGGAGAAAATTCCAGTGTC-3’，所述AGR2基因特异性PCR的上游引物包括酶切位点；所述AGR2基因特异性PCR的下游引物序列如SEQIDNO：2所示，具体为5’-TTACAATTCAGTCTTCAGCA-3’。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的载体为原核表达载体pMAL-c2。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将人源AGR2基因和所述原核表达载体pMAL-c2酶切、连接，得到重组表达载体pMAL-AGR2-MBP；通过突变PCR在所述pMAL-AGR2-MBP中删除MBP基因并插入His标签基因，得到AGR2重组表达载体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变PCR的上游引物序列如SEQIDNO：3所示，具体为5’-CACCACCACAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAGCCA-3’；所述突变PCR的下游引物序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：李大伟，江文丽，朱奇，赫迪希，武正华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31