本发明专利技术提供了一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。
【技术实现步骤摘要】
一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽HIP-13及其应用
本专利技术涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。
技术介绍
癌症是造成人类死亡的主要死因，是当前危害人类健康的一类重大疾病。根据国际癌症研究机构统计，2012年全球共有1410万新病例和820万例死亡病例。虽然在过去几十年中，因手术、放化疗等方法的进步，肿瘤治疗取得了长足的进步，但这些方法在治疗的同时，往往副作用极大，而且大多数癌症仍然具有高复发率和死亡风险。因此，寻求新的治疗措施以提高癌症的生存率和治愈率是非常必要和迫切的。近年来兴起的分子靶向治疗是在分子水平上，针对已明确的致癌靶点，设计相应的治疗药物，特异地选择致癌靶点发挥作用，杀伤肿瘤细胞，而不影响正常组织细胞。近年来，新型分子靶向药物在临床实践中取得了显著的疗效，将癌症的治疗推向了一个新阶段。靶向性多肽是目前认为比较理想的肿瘤分子靶向治疗手段。寻找可能与肿瘤细胞内某些特殊基因特异结合的短肽，能达到靶向治疗肿瘤的目的。人抗原R(humanantigenR，HuR)是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(embryoniclethalabnormalvision，ELAV)蛋白家族成员，在多种人类肿瘤组织和细胞中高表达，如乳腺癌、胃癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌和肺癌，与肿瘤进展、转移和预后相关。HuR能调控生长因子和细胞因子的mRNA稳定性，如p21、c-fos、c-Myc、p53、cyclinA、cyclinE1、COX-2，调控肿瘤细胞生长、增殖和凋亡。HuR活性形式与多种肿瘤的恶性程度成正相关。以HuR为靶点的抗肿瘤药物将为肿瘤治疗提供新的思路，为肿瘤的诊断及治疗带来新突破。然而，目前尚没有靶向HuR的抗肿瘤药物的相关报道。因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。
技术实现思路
为解决以上问题，专利技术人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。基于该研究，本专利技术提供了一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌基因HuR与RNA的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。本专利技术还提供了上述可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端本专利技术还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的优点在于，本专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接HuR的RNA结合活性肽段后，在细胞水平可观察到明显的肿瘤抑制效应。本专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。附图说明图1为HIP-13竞争性拮抗HuR蛋白与RNA相互作用原理的示意图；图2为对照肽和HIP-13处理HeLa细胞48小时后的荧光显微镜照片；图3为用不同浓度的HIP-13或对照肽处理HeLa的MTT比色统计图；图4为20μmol/L的HIP-13或对照肽处理HeLa细胞不同时间后的MTT比色统计图；图5为平板克隆形成实验照片；图6为根据图5计算的细胞克隆数的统计图；图7为Transwell细胞侵袭实验照片；图8为根据图7计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；图9为RNA免疫共沉淀实验(RIP)照片；图10为根据图9计算的PCDHB2mRNA水平统计图；图11为根据图9计算的SLC2A4mRNA水平统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.抗肿瘤多肽的合成通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQIDNO:1所示，穿膜结构域序列如SEQIDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-VAGHSLGYGFVNK(SEQIDNO:3)，命名为HIP-13。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin，由上海强耀生物科技有限公司合成，经高效液相色谱和质谱鉴定，纯度为95％以上。将多肽溶于无菌PBS缓冲液，浓度为1mmol/L，避光冻存于-80℃备用。HIP-13竞争性拮抗HuR蛋白与RNA相互作用的原理如图1所示。2.HIP-13的细胞定位检测胰酶消化HeLa细胞后，重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液、计数。以20000个/孔的细胞密度种入24孔培养板内。滴加细胞悬液时，根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起。待细胞贴于爬片后，利用FITC标记的靶向肽及对照肽(终浓度为20μmol/L)孵育HeLa细胞，48小时后加入4％多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3分钟。用DiI(细胞膜红色荧光探针，碧云天公司，货号C1036)以终浓度5μl对细胞膜进行染色，并用DAPI染料对细胞核进行染色，封片后于共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞对多肽的摄取及多肽定位。实验结果如图2所示，HIP-13能够有效被细胞摄取，48小时后多肽积聚于肿瘤细胞的细胞核，呈现强胞核染色。3.MTT比色法分析检测HIP-13对肿瘤细胞生长的抑制作用取处于对数生长期的HeLa细胞，以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板，按照实验需要用不同浓度多肽处理细胞，每组6个复孔；将未处理组设置为对照组。按照需要培养不同时间。在上述各组癌细胞中分别加入0.5％MTT20μl/孔，继续培养4小时，弃去上清，加入DMSO100μl/孔，室温下振荡至结晶溶解，立即于酶标仪490nm波长处测定吸光度(A)值。每次实验重复3次。癌细胞增殖活性抑制率(％)＝(1-实验组平均吸光度A值/对照组平均吸光度A值)×100％。结果如图3和4所示，与对照组多肽相比，HIP-13多肽处理的肿瘤细胞的活力显著降低，并且该作用呈时间和剂量依赖性，说明该新型多肽可有效降低肿瘤细胞的细胞活力；当处理细胞时间相同时，多肽浓度为15-25μmol/L的细胞活力抑制率较高；当处理细胞浓度相同时，多肽处理时间为24-48小时的细胞活力抑制率较高4.平板克隆形成实验检测HIP-13对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用取对数生长期的单层培养HeLa细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在培养液中备用。将细胞悬液计数后作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度300个/孔接种于培养板中(每视野可见5-6个细胞为好)。待细均匀贴壁后，按照实验需要处理细胞，并设置未处理对照组。置37℃、5％CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2-3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇，固定15分钟。去固本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的可拮抗HuR蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑丽端，童强松，陈亚俊，杨枫，李欢欢，叶霖，李聃，宋华杰，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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