一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽PIP-14及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明专利技术的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽PIP-14及其应用
本专利技术涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。
技术介绍
肿瘤严重影响着人类的健康，是世界范围内一个主要的致死因素。目前已有的抗肿瘤方法虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在疗效低、选择性差、毒副反应大、易产生耐药等问题。因此，寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。肿瘤靶向治疗是指在分子水平上，通过药物靶向作用于肿瘤细胞，使其特异性死亡，而不影响正常组织细胞。与传统细胞毒化疗不一样，肿瘤分子靶向治疗具有特异性抗肿瘤作用，且毒性明显减少。肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收，还可以通过提高机体免疫功能，抑制肿瘤的生长和转移，增强抗肿瘤作用，因此，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。例如，抗肿瘤尿蛋白(ANUP)是人体尿液中一种具有抗肿瘤和抗血管生成作用的蛋白质。Kathleen等人工合成了与ANUP的N端同源的2个多肽，发现对人宫颈癌细胞HeLa的抑制率达到70％，鸡胚胎尿绒毛膜试验结果表明，这2个多肽都具有抑制血管生成的作用。人多聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)广泛表达于肿瘤细胞中，其主要参与DNA损伤修复，影响放化疗药物的作用。研究表明：对PARP1活性的抑制可增加放化疗的敏感性。PARP1在肿瘤中的广泛表达使得它成为肿瘤治疗的潜在靶标。人类PARP1蛋白由1014个氨基酸残基组成，相对分子量为116kDa，含有四个功能域(图1)，即N端的DNA结合区(包括三个锌指结构域ZnⅠ、ZnⅡ、ZnⅢ)、C端的催化域(CAT)、中间的自修饰域(BRCT)与RNA结合域(WGR)。经典的PARP1抑制剂如PJ-34通过抑制PARP1的酶活性，从而达到抗肿瘤的作用。其中，WGR结构域是一段由79个氨基酸组成的活性区域，存在于polyA聚合酶和调控大肠杆菌钼酸盐代谢的因子中,目前推测该区域具有结合核酸的能力。对WGR进行靶向阻遏，能够影响蛋白质-核酸复合物的形成，从而达到治疗肿瘤的作用。多肽代谢快、无毒副作用的特点对靶向治疗药物的研发具有指导意义，有望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。靶向PARP1蛋白WGR结构域的多肽尚未见报道。因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。
技术实现思路
为解决以上问题，专利技术人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。基于该研究，本专利技术提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。实验证明，该多肽可竞争性拮抗促癌蛋白PARP1与RNA的结合，并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。本专利技术还提供了上述可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。本专利技术还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术的优点在于，本专利技术的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接PARP1的RNA结合活性肽段后，有明显的抑制肿瘤活性的作用。附图说明图1为PARP1蛋白的结构域示意图；图2为对照肽和PIP-14处理肿瘤细胞48小时后的荧光显微镜照片；图3为PC-3细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图；图4为SH-SY5Y细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图；图5为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理PC-3细胞不同时间的细胞活性统计图；图6为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理SH-SY5Y细胞不同时间的细胞活性统计图；图7为平板克隆形成实验照片；图8为根据图7计算的细胞克隆数的统计图；图9为软琼脂克隆形成实验照片；图10为根据图9计算的细胞克隆数的统计图；图11为Transwell细胞侵袭实验照片；图12为根据图11计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图；图13为肿瘤细胞的血管形成活性抑制实验照片；图14为根据图13计算的肿瘤细胞的相对血管形成活性统计图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.抗肿瘤多肽的合成通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQIDNO:1所示，穿膜结构域序列如SEQIDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-DIVKGTNSYYKLQK(SEQIDNO:3)，命名为PIP-14。为了研究方便，我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC，N端连接生物素标记Biotin。2.PIP-14的细胞定位检测取对数期生长的肿瘤细胞，用无菌1×PBS重悬，经过计数后按每孔10000个细胞种植于内置无菌爬片的24孔板内，吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养过夜后加入20μmol/L的多肽，维持48小时。弃去上清，1×PBS洗两次后采用4％多聚甲醛固定，室温固定30分钟后弃甲醛，用1×PBS洗两次，然后采用DAPI染核，3-5分钟后再次用1×PBS洗两次，然后纯甘油制片，整个操作过程均要求严格避光；制片结束后在激光共聚焦显微镜下观察带有FITC荧光基团的多肽在细胞内的定位。实验结果如图2所示，PIP-14能够有效被细胞摄取，并积聚于肿瘤细胞的细胞核，呈现强胞核染色。3.MTT比色法分析检测PIP-14对肿瘤细胞生长的抑制作用取对数生长期的SH-SY5Y、PC-3细胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至5×104个/ml，然后加入96孔板中，每孔100μl。将培养板置于恒温37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。培养24小时后，细胞完全贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μl的含有不同浓度多肽的DMEM基础培养基，并以另一合成多肽为对照组，将培养板置于恒温37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。48小时后吸出培养液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl；于恒温37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。48小时后吸出培养液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl；于恒温37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。4小时后，弃去含有MTT的培养液，加入150μlDMSO后于微型振荡器上振荡15min。在OD490nm用酶标仪处测量各孔的吸光值，计算IC50。结果如图3-6所示，该多肽能显著抑制SH-SY5Y和PC-3细胞的增殖活性，且呈剂量依赖性，经计算IC50约为50μmol/L，而对照肽无此抑制作用(图3和4)。用50μmol/L剂量的多肽，处理不同时间，显示出时间依赖性(图5和6)4.克隆形成实验检测PIP-14对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用取经对数生长期SH-SY5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：童强松，郑丽端，方二虎，王晓静，宋华杰，杨枫，叶霖，李聃，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42