一种星孢菌素类化合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种星孢菌素类化合物及其制备方法和应用，该化合物为式I结构，该类化合物利用大米培养基发酵方法，从放线菌固体发酵产物中分离制备得到。该化合物具有抗肿瘤活性，可用于制备抑制前列腺炎的药物和抗前列腺癌症类的药物，也可作为Brd4蛋白活性抑制剂。

【技术实现步骤摘要】
一种星孢菌素类化合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及海洋微生物药物领域
，具体涉及一种星孢菌素类化合物及其制备方法和应用。
技术介绍
自1977年第一个星孢菌素类staurosporine(STA)从StreptomycesstaurosporeusAM-2282的发酵产物中分离得到以来，在过去的30年里，人们从不同的天然来源中分离得到了大量的吲哚咔唑类生物碱。据统计，有100多个此类化合物从海洋无脊椎动物和放线菌、蓝细菌以及其他微生物的发酵产物中分离得到。这些化合物的母核结构相似，主要由吲哚咔唑母环和连接在吲哚环上的糖环构成，而结构差别主要是在母环上的取代基的不同以及糖基取代方式不同。生物活性研究表明，staurosporine对PKC具有强抑制活性，IC50为3nM；而rebeccamycin则表现出很好的拓扑异构酶I抑制活性，其IC50为1.75μM。而且多个吲哚咔唑类生物碱，如活性高、毒副作用小的UCN-01、PKC-412、CEP-2563和Enzastaurin等已进入临床试验研究。正是因为吲哚咔唑类生物碱的独特结构和良好的生物活性引起了许多有机化学家和药物学家浓厚的兴趣和热切的关注。鉴于此，本专利技术人对星孢菌素的链霉菌DT-A65进行研究，从大米固体发酵物中共分离得到3个具有抗肿瘤活性的星孢菌素类化合物,为抗肿瘤药物的开发提供资源。
技术实现思路
本专利技术提供了一种星孢菌素类化合物及其制备方法和应用，该化合物具有抗肿瘤活性，该类化合物利用大米培养基发酵方法，从放线菌固体发酵产物中分离制备得到。一种星孢菌素类化合物，为式I结构：其中，R1＝H或Me；R2＝H或Me；R3＝H或OH；R4＝H或OHR5＝H或OH；R6＝H或OH。进一步优选，所述的星孢菌素类化合物，为以下化合物；所述的星孢菌素类化合物的制备方法，由海洋放线菌固体发酵产生，经分离纯化得到，易于操作和实施。所述的星孢菌素类化合物的制备方法，包括以下步骤：1)将海洋放线菌接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，获得种子液；步骤1)中，所述的摇床培养的条件为：在23℃～33℃、100rpm～260rpm摇床培养2天～6天，进一步优选，所述的摇床培养的条件为：在26℃～30℃、160rpm～200rpm摇床培养3天～5天；更进一步优选，在28℃、180rpm恒温摇床培养4天；2)将上述获得的种子液接种于大米固体培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物；步骤2)中，所述的静置培养的条件为：在23℃～33℃静置培养45天～75天，进一步优选，在26℃～30℃静置培养55天～65天，更进一步优选，在28℃静置培养60天；3)将上述获得的发酵产物进行分离纯化后，获得式I结构的星孢菌素类化合物；步骤1)中，所述的放线菌，可采用现有技术，具体可采用市售产品，如采用北京北纳创联生物技术研究院出售的链霉菌Streptomycessp.ATCC21176，订购网址：http://www.bnbio.com/。步骤2)中，所述的大米固体培养基，由大米和海水组成，大米质量与海水体积比30g～50g：40ml～80ml配比所得，进一步优选，大米质量与海水体积比35g～45g：50ml～70ml配比所得，大米质量与海水体积比40g：60ml配比所得。步骤3)中，所述的分离纯化包括：由乙酸乙酯等体积萃取获得的发酵产物，经凝胶柱色谱、高效液相制备色谱获得星孢菌素类化合物。所述的凝胶柱色谱的条件：采用的填料为羟丙基葡聚糖凝胶(LH-20)，采用的流动相体积百分数比为20％-100％的甲醇-水溶液。所述的高效液相制备色谱的条件：采用的填料为十八烷基键合硅胶，采用的流动相体积百分数为60％至80％甲醇-水溶液，或为40％至80％的含三氟乙酸甲醇-水的溶液，或为40％至60％的乙腈-水的溶液。其中，所述的含三氟乙酸甲醇-水的溶液中三氟乙酸(TFA)的质量百分数为0.02％～0.1％，进一步优选，为0.05％。本专利技术采用人前列腺癌细胞株PC3细胞进行活性评价试验，本专利技术提供的化合物对PC3细胞的增殖具有不同程度的抑制作用。所述的抗肿瘤活性的化合物，表现出强的人前列腺癌细胞株PC3细胞抑制作用，可应用于制备抑制前列腺炎的药物和抗前列腺癌症类的药物。本专利技术采用Brd4bromodomain1TR-FRETassaykit(Cisbio)进行活性评价试验，本专利技术提供的化合物能在不同程度抑制Brd4蛋白，作为Brd4蛋白活性抑制剂，所述的抑制Brd4蛋白活性化合物在用于抗癌、抗炎、抗艾滋病潜伏药物中的应用，所述的癌为黑色素瘤、急性髓系白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤；所述的炎症包括关节炎、皮肤炎等。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术具有几种具有抗肿瘤活性的化合物，可用于开发治疗与前列腺癌细胞抑制剂相关的疾病的药物；并且能在不同程度抑制Brd4蛋白，可用于制备Brd4蛋白抑制剂，用于预防和治疗与Brd4蛋白抑制剂有关的疾病，疾病包括黑色素瘤、急性髓系白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤。该化合物由放线菌大米发酵产生，可通过对固体培养物进行乙酸乙酯萃取后，再用硅胶这层析、凝胶柱层析和反相色谱分离纯化，而且发酵完的大米可以作为肥料利用，绿色环保，有利于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。具体实施方式实施例1放线菌采用北京北纳创联生物技术研究院出售的链霉菌Streptomycessp.ATCC21176，订购网址：http://www.bnbio.com/。1)将放线菌接种于500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号培养基，在28℃、180rpm下摇床培养4天，得到接种有放线菌的种子液；2)将步骤1)的接种有放线菌的接种液至大米培养基(大米培养基，由以下组分制成：大米40g；海水60mL)，接种体积为8mL，在28℃下静置培养60天，得到含有本专利技术的具有抗肿瘤活性的星孢菌素类化合物的固体发酵产物。实施例2将含有本专利技术的具有抗肿瘤活性的星孢菌素类固体发酵产物用乙酸乙酯萃取3次，溶剂回收浓缩，获得粗体物。将所得粗体物采用LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇比例20％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，TLC分析合并有新化合物的组馏分。所得含有新化合物的组分采用高效液相制备色谱分离(AgilentPursuitC-18(10μm,21.2×250mm)色谱柱，检测波长292nm)，采用的流动相为体积百分数40％-60％乙腈/水体系60min以10mL/min梯度洗脱，回收溶剂，得到以下新的化合物,通过表征数据表明，新的化合物为化合物1、2和3：化合物1，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表1所示：表1NMR数据(溶剂CD3OD)化合物2，该化合物的结构如下所示，NMR数据如表2所示：表2NMR数据(溶剂CD3OD)实施例3人前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖抑制实验。取对数生长期的细胞，配置成5×104个/mL，以100μl/孔铺于96孔培养板，CO2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种星孢菌素类化合物，其特征在于，为式I结构：

【技术特征摘要】
1.一种星孢菌素类化合物，其特征在于，为式I结构：其中，R1＝H或Me；R2＝H或Me；R3＝H或OH；R4＝H或OHR5＝H或OH；R6＝H或OH。2.根据权利要求1所述的星孢菌素类化合物，其特征在于，为以下化合物；3.根据权利要求1或2所述的星孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将海洋放线菌接种于高氏一号液体培养基中，摇床培养，获得种子液；2)将上述获得的种子液接种于大米固体培养基中，静置培养，萃取获得发酵产物；3)将上述获得的发酵产物进行分离纯化后，获得式I结构的星孢菌素类化合物。4.根据权利要求3所述的星孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的摇床培养的条件为：在23℃～33℃、100rpm～260rpm摇床培养2天～6天。5.根据权利要求3所述的星孢菌素类化合物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的静置培养的条件为：在23℃～33℃静置培养45天～75天。6.根据权利要求3所述的星孢菌素类化合物的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：马忠俊，周彪，丁婉婧，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33