一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法技术

本发明专利技术公开了一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法，克隆了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列分析发现SiARGOS基因开放阅读框342bp，编码114个氨基酸，其蛋白具有农作物ARGOS蛋白典型的富含亮氨酸结构域，启动子区域2109bp，含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。系统发育分析表明，谷子ARGOS蛋白跟玉米ARGOS蛋白同源性最高。表达分析发现，SiARGOS基因在晋29A，K186及其杂种F1的根中表达水平差异很大。SiARGOS基因等位变异分析发现，SiARGOS基因ORF存在1个SNP，启动子区存在19个SNP和2个InDel，共发现4个单倍型，我们开发了三个功能标记，其中包括1个CAPS标记和2个SSR标记。

Cloning and expression analysis of a kind of millet SiARGOS gene and the development method of functional marker

The invention discloses a cloning and expression of SiARGOS gene in Millet development method analysis and functional markers, cloning millet encoding region of SiARGOS gene and its promoter sequence, SiARGOS gene sequence analysis revealed an open reading frame of 342bp, encoding 114 amino acids, the protein with leucine rich domain protein typical crops ARGOS promoter region 2109bp, containing with auxin, jasmonic acid and ethylene, gibberellin and other plant hormone regulation related element. Phylogenetic analysis showed that the ARGOS protein of millet was the most homologous to maize ARGOS protein. The expression analysis showed that the expression level of SiARGOS gene in the roots of Jin 29A, K186 and its hybrid F1 was very different. Allelic variation analysis of SiARGOS gene revealed that there were 1 SNP in SiARGOS gene ORF, 19 SNP and 2 InDel in the promoter region, and 4 haplotypes were found. We developed three functional markers, including 1 CAPS markers and 2 SSR markers.

【技术实现步骤摘要】
一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。
技术介绍
作物产量性状与植株器官大小存在密切关系，植物器官大小除受光照、温度、营养和激素等外境环境条件影响外，主要受基因表达和信号转导等遗传因子调控，研究认为，细胞总数目的增加和单细胞体积增大两个连续并相关的过程控制植物器官的大小，而植物器官大小在不同物种中差异显著但在物种内个体之间却相对一致，说明器官发育过程中，细胞分裂受到遗传物质的严格控制。前人已经克隆和研究了许多控制植物器官大小的相关基因，如ANT、ARF2、ARGOS、AtTOR、AtEBP1、BB和KLUH等，其中，ARGOS基因在拟南芥、水稻、玉米、大白菜、萝卜、紫花苜蓿中通过调控细胞数目或细胞体积来调节植物器官大小。2003年，在拟南芥中首次发现了ARGOS基因，该基因受生长素上调表达并通过“auxin→AXR1基因→ARGOS基因→ANT基因”信号通路实现细胞增殖和器官生长的调节；水稻OsARGOS基因也受生长素诱导上调表达，转基因植株侧生器官的花和叶片变大，角果数目和种子数量增多；玉米ZmARGOS受乙烯下调表达并参与器官大小的调控，拟南芥转基因植株抗旱性提高，ZmARGOS8基因超表达，转ZmARGOS8基因玉米产量大幅提高。目前，谷子ARGOS基因及其启动子研究尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。用同源克隆方法获得了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，用生物信息学方法分析了SiARGOS基因蛋白序列和启动子的顺式作用元件，采用荧光定量PCR方法分析了SiARGOS基因在谷子杂种中的表达差异，还对该基因编码区及其启动子序列进行了SNP和单倍型分析，同时开发了3个SiARGOS基因功能标记。其具体技术方案为：一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，包括以下步骤：通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件PrimerPremier5.O设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列。PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GCBuffer10μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaqDNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL。PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸约2kb，用软件PrimerPremier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件(除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min)同上，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列。将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。一种SiARGOS基因的表达分析方法，包括以下步骤：蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法。分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F13d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-RadC1000cyclerrealtimePCRsystem进行实时荧光定量PCR分析。实时定量引物为SiArgos-RT-F：TTGCGTCGACTTACTTCAGC，SiArgos-RT-R：CATGCTCCTCACATCGGTTG。以谷子ACTIN基因作为对照(SiActin-F：TTCCCTGGTATTGCTGACCG，SiActin-R：CTCACCCTTCGAGATCCACA)。反应总体积10μL，包括：1/10cDNAtemplate(反转录第一链)1μL，SYBRPremixExTaq(DRR041D)5μL，2μmol/L特异引物1μL，ddH2O3μL。RT-PCR扩增程序：首先，94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。65℃-98℃绘制溶解曲线。采用比较阈值法进行定量分析，手工设定荧光阈值，确定循环数Ct值，根据Ct值，计算个样本的C值，C＝2-ΔCt，ΔCt＝Ct目标基因-Ct内标基因。实验设置3次生物学重复并采用双尾等方差t检验的方法进行显著性检验(P＜0.05)。一种SiARGOS基因功能标记的开发方法，包括以下步骤：对19份谷子材料进行基因编码区及启动子全长测序，用引物Siargos和Argos-Pro分别进行SiARGOS基因编码区和启动子扩增，用PCR产物进行克隆测序，利用DNAstar软件系统的Sequman、Editseq和MegAlign软件包进行DNA序列的分析，包括拼接、整理与SNP和单倍型分析。引物Siargos的扩增产物经限制性内切酶AccII(CGˇCG)酶切后的片段差异，用于检测151bp位点的碱基差异；根据启动子区2处插入和缺失设计SSR引物AP-1和AP-2，用于启动子区的单倍型分型，其中AP-1-F：AGATGACTCTAAAGGGCATCG，AP-1-R：CAAGGGCAGCAGTGTTTTC；AP-2-F：GTCTTTTGGGATTGTGTCATC，AP-2-R：TGACTAATGTGGTACGGGTC。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术克隆了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列分析发现SiARGOS基因开放阅读框342bp，编码114个氨基酸，其蛋白具有农作物ARGOS蛋白典型的富含亮氨酸结构域，启动子区域2109bp，含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。系统发育分析表明，谷子ARGOS蛋白跟玉米ARGOS蛋白同源性最高。表达分析发现，SiARGOS基因在晋29A，K186及其杂种F1的根中表达水平差异很大。SiARGOS基因等位变异分析发现，SiARGOS基因ORF存在1个SNP，启动子区存在19个SNP和2个InDel，共发现4个单倍型，开发了三个功能标记，其中包括1个CAPS标记和2个SSR标记。附图说明图1SiARGOS基因及其启动子的扩增图谱，其中，A为SiARGOS基因的扩增，M：100bpDNAmarker；1：晋29A；2：K186；B为SiARGOS启动子的扩增，M：200bpDNAmarker；1：晋29A；2：K1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos‑1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos‑1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列；PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer10μL，10mmol/L dNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL；PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测；根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸2kb，用软件Primer Premier5.0设计启动子区PCR引物Argos‑Pro，引物序列为：Argos‑Pro‑F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos‑Pro‑R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件：除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列：将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。...

【技术特征摘要】
1.一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件PrimerPremier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列；PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GCBuffer10μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaqDNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL；PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测；根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸2kb，用软件PrimerPremier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件：除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列：将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。2.一种SiARGOS基因的表达分析方法，其特征在于，包括以下步骤：蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法；分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F13d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-RadC10...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，王智兰，杜晓芬，杨慧卿，王玉文，郭二虎，袁峰，田岗，李会霞，刘鑫，张林义，彭书忠，
申请(专利权)人：山西省农业科学院谷子研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14