降低PCV‑2组合物杀病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV‑2组合物技术

本发明专利技术提供降低包含PCV‑2抗原之组合物之杀病毒活性的方法，以及包含PCV‑2抗原之抗原性制剂及免疫原性组合物，其杀病毒活性已降低。此外，本发明专利技术亦关于一种提高包含PCV‑2抗原之免疫原性组合物之免疫原性的方法，以及具有提高免疫原性之免疫原性组合物。

Reduce the PCV 2 composition virucidal activity method and has improved the immunogenicity of PCV 2 composition

The present invention provides reduced composition contains PCV 2 antigen of virus killing activity, and include the PCV antigen preparation and antigenicity of 2 immunogenic compositions, the virucidal activity has been reduced. In addition, the invention also relates to a method of immunization for improving immune antigens including PCV 2 original compositions of the original, and can improve the immunogenicity of immunogenic compositions.

【技术实现步骤摘要】
降低PCV-2组合物杀病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV-2组合物本专利技术是基于申请日为2010年9月2日，申请号为“201080048350.5”(国际申请号为PCT/US2010/047654)，专利技术名称为“降低PCV-2组合物杀病毒活性之方法及具有改良免疫原性之PCV-2组合物”的专利申请的分案申请。本申请涉及并要求2010年3月1日提交的美国临时专利申请No.61/309,408和2009年9月2日提交的美国临时专利申请No.61/239,192的优先权。通过述及将它们都完整收入本文。所有申请是共同拥有的。序列表依照37C.F.R.1.821–1.825，本申请包括序列表。在此通过述及完整收录伴随本申请的序列表。专利
本专利技术系关于用于降低通常会具有一定程度之杀病毒活性的组合物之杀病毒活性的方法及组合物。藉由使用本专利技术方法可使该等组合物之杀病毒活性与不包括本专利技术步骤的组合物之杀病毒活性相比降低。更特定言之，本专利技术系关于制备抗原性II型猪环状病毒(PCV-2)组合物之方法，特征在于使用当前检测方法，该等组合物与在此项技术中已知之组合物相比，尤其与并非藉由本专利技术方法制备之组合物相比不具有或具有较低杀病毒活性。本专利技术进一步系关于一种新颖免疫原性组合物，较佳为根据本专利申请案提供之方法制备的含有PCV-2之组合物，其较佳特征在于相对于此项技术中已知之可比组合物，具有降低的或不具有杀病毒活性。根据另一方面，本专利技术亦提供包含纯化PCV-2抗原(较佳具有改良免疫原性之纯化PCV-2抗原)的免疫原性组合物。先前技术2型猪环状病毒(PCV-2)为小型(直径为17-22nm)二十面体无包膜DNA病毒，其含有单链圆形基因组。PCV-2与1型猪环状病毒(PCV-1)具有约80％序列同一性。然而，与通常无毒力之PCV-1相比，感染有PCV-2之猪展现通常称为断乳后多系统消耗性症候群(PMWS)之症候群。PMWS之临床特征为消瘦、皮肤苍白、身体憔悴、呼吸窘迫、腹泻及黄疸(icterus/jaundice)。在一些受感染之猪中，所有症状之组合将显而易见而其它猪将仅仅具有此等症状中之一或两者。在尸检期间，显微镜可见及肉眼可见之病损亦出现于多个组织及器官上，淋巴器官为最常见之病损部位。已观测到PCV-2核酸或抗原之量与显微镜可见淋巴病损的严重性之间强相关。感染有PCV-2之猪之死亡率可达80％。除PMWS外，PCV-2与包括以下之若干其它感染相关：假性狂犬病、猪生殖及呼吸症候群(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser'sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝障碍及化脓性支气管肺炎。可利用若干疫苗来减少PCV-2感染对猪之影响。美国专利第6,703,023号提供用于预防猪之PMWS的基于DNA之疫苗。在WO03/049703中，描述活嵌合疫苗之制备，该疫苗包含非病原性PCV1病毒，但其中ORF2蛋白经病原性PCV-2之ORF2蛋白置换。WO99/18214及WO99/29717已提供制备PVC2死疫苗之程序及若干PCV-2株。WO99/18214及WO99/29717亦已描述亚单位疫苗之制备。WO06/072065已报导基于ORF2之有效亚单位疫苗。WO07/28823亦描述另一基于ORF-2之亚单位疫苗。然而，先前技术中所述之疫苗均不包括非杀病毒及/或纯化的PCV-2抗原，较佳高度纯化之PCV-2ORF2抗原。针对PCV-2之免疫原性组合物及针对其它病原体之各种免疫原性组合物常常对其他抗原具有杀病毒效应。当前管理标准(9CFR113.35)允许多价组合物中有一些杀病毒活性，但在与免疫原性组合物之其它组份组合时，此杀病毒活性不能造成超过0.7log/ml之活病毒或小于0.7log/mlCFU之活细菌的损失。杀病毒活性高于所允许者之组合物不能与其它抗原组合来形成多价疫苗。PCV-2之可读框2(ORF2)蛋白当在SDS-PAGE凝胶上跑行时具有30kDa之近似分子量，其在以往用作PCV-2之疫苗及免疫原性组合物中之抗原组份。获得适用于该等疫苗及组合物中的ORF2之典型方法一般由以下步骤组成：扩增编码ORF2之PCV-2DNA、在宿主细胞内表达ORF2蛋白及经由细胞溶解自宿主细胞提取ORF2蛋白。接着将回收的ORF2细胞溶解物用作免疫原性组合物或疫苗之抗原部分。在一些情况下，将含有ORF2之细胞溶解物与细胞碎片分离。需要一种降低含有PCV-2之免疫原性组合物及其中之抗原的杀病毒活性的方法，以便满足管理要求且施用有效的多价组合物。另外需要减小或降低含有PCV-2之组合物对猪生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)之杀病毒活性及效应的方法。另外需要彼等免疫原性组合物，其已经历本专利技术方法使得其杀病毒活性已降低至可接受标准且可与其它抗原组合以形成多价免疫原性组合物。专利技术概述除非另有所述，否则本专利技术之实施将采用此项技术技能范围内之分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学常规技术。文献中充分解释了该等技术。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第I,II及III卷，第二版(1989)；DNACloning,第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1984)；AnimalCellCulture(R.K.Freshney编，1986)；ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLpress,1986)；Perbal,B.,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；theseries,MethodsInEnzymology(S.Colowick及N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)；Proteinpurificationmethods-apracticalapproach(E.L.V.Harris及S.Angal编，IRLPressatOxfordUniversityPress)；及HandbookofExperimentalImmunology,第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编，1986,BlackwellScientificPublications)。在详细描述本专利技术之前，应了解本专利技术不限于特定DNA、多肽序列或过程参数，其当然可变化。亦应了解本文中所使用之术语仅为了达成描述本专利技术之特定实施方案之目的且并非意欲限制本专利技术。应注意，除非文中明确另外指示，否则如本说明书及随附权利要求所用之单数形式“一”及“该”包括复数个指示物。因此，举例而言，“一抗原”包括两种或两种以上抗原之混合物，“一赋形剂”包括两种或两种以上赋形剂之混合物，诸如此类。本专利技术解决先前技术中所固有之问题且相对于当前技术有明显进步。一般而言，本专利技术提供一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备PCV‑2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV‑2抗原之第一液体；及ii)自该PCV‑2抗原移除至少一部分该第一液体。

【技术特征摘要】
2009.09.02 US 61/239,192;2010.03.01 US 61/309,4081.一种制备PCV-2抗原性组合物之方法，其包含以下步骤：i)获得含有PCV-2抗原之第一液体；及ii)自该PCV-2抗原移除至少一部分该第一液体。2.如权利要求1之方法，其中藉由以第二液体交换该第一液体之该部分而自该PCV-2抗原移除该第一液体之该部分，其中该第二液体不同于该第一液体。3.如权利要求2之方法，其中以该第二液体交换该第一液体之该部分包含以下步骤：a)包含将该第二液体添加至含有该PCV-2抗原之该第一液体中的液体添加；及b)藉由移除一部分该第一及第二液体浓缩该PCV-2抗原。4.如权利要求1至3中任一项之方法，其中使用过滤器，藉由过滤步骤自该PCV-2抗原移除该第一液体之该部分。5.如权利要求3至5中任一项之方法，其中实质上同时执行该浓缩步骤及该液体添加步骤。6.如权利要求3至6中任一项之方法，其中至少两次执行该浓缩步骤及该液体添加步骤。7.如权利要求4至6中任一项之方法，其中该过滤器包括半透膜。8.如权利要求7之方法，其中该半透膜具有小于该PCV-2抗原之平均孔径，藉此防止至少90％该PCV-2抗原通过该半透膜孔且将该PCV-2抗原截留在该过滤器内。9.如权利要求4至8中任一项之方法，其中该过滤器具有防止至少90％大小为50kDa至500kDa之蛋白质通过的平均孔径。10.如权利要求3至9中任一项之方法，其中该浓缩步骤使该抗原与该第一液体之体积相比浓缩3倍至50倍。11.如权利要求1至10中任一项之方法，其中该PCV-2抗原性组合物之杀病毒活性与未经历该方法之该液体相比降低至少10％。12.如权利要求1至11中任一项之方法，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合2小时或2小时以上时，由步骤i)至ii)制备的PCV-2抗原性组合物造成小于1logTCID50/ml该活病毒或小于1logCFU/ml该活细菌之损失。13.如权利要求1至12中任一项之方法，其中当活病毒或活细菌与该PCV-2抗原性组合物混合2小时或2小时以上时，由步骤i)至ii)制备的PCV-2抗原性组合物造成小于0.7logTCID50/ml该活病毒或小于0.7logCFU/ml该活细菌之损失。14.如权利要求1至13中任一项之方法，其中该方法进一步包含收获在步骤ii)之后剩余PCV-2抗原之步骤。15.如权利要求14之方法，其中该方法进一步包含藉由层析程序纯化包含该PCV-2抗原之步骤ii)收获物的步骤。16.如权利要求15之方法，其中该PCV-2抗原经纯化至以蛋白质总量计超过50％(w/w)之该PCV-2抗原之纯度等级。17.如权利要求1至16中任一项之方法，进一步包含将步骤ii)后剩余的PCV-2抗原与选自由以下组成之群的另一组份混合之步骤：医药学上可接受之载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合。18.如权利要求17之方法，其中该另一组份为佐剂。19.如权利要求18之方法，其中该佐剂为卡波姆(Carbomer)。20.如权利要求1至19中任一项之方法，其中该PCV-2抗原包含PCV-2之ORF-2蛋白。21.如权利要求1至20中任一项之方法，其中该PCV-2抗原包含ORF-2蛋白之病毒样粒子。22.如权利要求1至21中任一项之方法，其中该方法进一步包含将该PCV-2抗原性组合物与至少一种其它抗原组合之步骤。23.如权利要求22之方法，其中该至少一种其它抗原包括猪生殖及呼吸症候群病毒抗原及/或猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)抗原。24....

【专利技术属性】
技术研发人员：CA科勒，赵国颂，A卡兹雷纳兹普尔，BC艾肯穆勒，M艾克梅耶，G海威克，M谢弗，
申请(专利权)人：贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US