靶向克雷伯氏肺炎菌半乳聚糖类O‑抗原的抗体制造技术

本发明专利技术提供一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O‑抗原结构的半乳聚糖‑III表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖‑III重复单元内，其中所述半乳聚糖‑III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物。本发明专利技术进一步提供一种包含所述抗体的药物或诊断制备物，及一种产生所述抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向克雷伯氏肺炎菌半乳聚糖类O-抗原的抗体
本专利技术涉及一种特异性识别独特半乳聚糖类O-抗原结构的单克隆抗体，所述抗体与大多数传染性耐多药克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)ST258结合。
技术介绍
克雷伯氏肺炎菌是一种重要的肠道菌病原体，会引发尿路感染、肺炎和败血症，导致严重的发病率和死亡率。最近，出现了耐多药(MDR)菌株，并且在全球扩散，这种菌株的治疗方法非常有限。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌(如克雷伯氏肺炎菌)外膜外叶的主要成分。LPS拥有结构上和功能上不同的三大部分：i)脂质A，亦称为内毒素，ii)核心寡糖，及iii)由寡糖嵌段(oligosaccharideblock)重复单元构成的O-抗原。克雷伯氏肺炎菌O-抗原是定义不同O-型的不同结构的表面抗原。在目前识别的7种O-型中，最常见的血清型是O1和O2，据报道，这两者被大多数(即>50％)分离株表达(1；2)。O1和O2抗原由半乳糖聚合物(即半乳聚糖)组成。O2抗原(亦称为O2a或O2ab，以与下文所述O2ac区分)由所谓的半乳聚糖-I二糖重复单元组成(参见图3)。与此相反，O1和O2ac抗原除包含半乳聚糖-I以外确实还包含其它以下不同结构：LPS核-近端部分由半乳聚糖-I重复单元组成，采用半乳聚糖-II(半乳糖的不同均聚物，O1时)加帽，或采用非半乳聚糖重复单元加帽(O2ac时)。共有半乳聚糖-IO-亚基的血清型携带编码合成和输出这种结构的高度类似rfb基因座。已经部分确定了编码半乳聚糖-I的操纵子的核苷酸序列(3)。根据描述，该基因座长7.3kb，包括6个基因。克隆的rfb基因座互补的克雷伯氏肺炎菌O1、大肠杆菌K-12或肠道沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)的粗糙型突变体恢复了由半乳聚糖-IO-抗原重复单元组成的光滑型LPS的生产。表明这6个基因是产生半乳聚糖-IO-抗原侧链必须的，也是足够的(3)。Kelly等公开了不同O2克雷伯氏菌菌株中D-半乳聚糖-I的结构修饰(5)。然而，仍然需要对这些修饰的遗传背景进行阐明。最近，有人对编码半乳聚糖-II重复单元(即，采用此处所述的对半乳聚糖-I或半乳聚糖-III加帽的那些)的遗传定子进行了描述(4)。重要的是，这些基因与引发半乳聚糖-I单元向半乳聚糖-III转化的遗传定子不相关。因此，O1血清型菌株，除了表达半乳聚糖-II重复单元的血清型决定表面之外，还可以表达连接脂质A-核和半乳聚糖-II重复单元的半乳聚糖-I或半乳聚糖-III重复单元。最近出现的克雷伯氏肺炎菌耐多药(MDR)菌株引发的感染占克雷伯氏肺炎菌感染的很大一部分。由于这些MDR菌株已经演变为对临床使用的大多数抗生素具有耐药性，因此，它们的治疗方法非常受限制。因此，替代的治疗方法，如单克隆抗体(mAb)被动免疫法将来拥有良好的前景。人们需要克雷伯氏肺炎菌的新靶标。特别是，需要鉴定免疫相关、可用于治疗和诊断的靶标。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种直接对抗克雷伯氏肺炎菌，特别是MDR菌株的抗体，其靶向病原体的相关性得到改善，用于预防或治疗克雷伯氏肺炎菌感染。本专利技术进一步的目的是提供能够快速、可靠地诊断克雷伯氏肺炎菌(如MDR菌株)的手段和方法。本专利技术的目的通过本专利技术的主题实现。根据本专利技术，提供一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O-抗原结构的半乳聚糖-III(gal-III)表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖-III重复单元内，其中所述半乳聚糖-III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物：特别是，所述半乳聚糖-III表位被包括在包含至少2个gal-III重复单元，或至少3、4或5个gal-III重复单元的O-抗原结构中。根据一个特定方面，相对半乳聚糖-I表位，所述抗体优先与半乳聚糖-III表位结合，或不与半乳聚糖-I表位交叉反应，其中半乳聚糖-I(gal-I)表位被包括在克雷伯氏肺炎菌LPSO2a-抗原结构的半乳聚糖-I重复单元中，其中半乳聚糖-I重复单元是式(II)的线性半乳糖均聚物。[→3)-β-D-Galf-(1→3)-α-D-Galp-(1→]式(II)。例如，本专利技术的抗体是gal-III特异性抗体，特异性识别或结合包括gal-III抗原的O-抗原结构。示例性抗体，或这些抗体的变体在图1和图2中列出。为了提供变体起见，此处的抗体被称为亲代(parent)抗体，CDR或构架(framework)序列在此处被称为亲代CDR序列或亲代构架序列。根据一个特定方面，所述抗体包括重组CDR序列和构架序列，例如，不同来源的序列，其中CDR序列和构架序列中的至少一个序列包括人、人源化、嵌合、鼠源或亲和力成熟的序列，优选其中的构架序列是任何免疫球蛋白同种型的构架序列，特别是IgG抗体的构架序列。特别是，本专利技术的抗体与gal-III表位及gal-I表位交叉特异性结合，相对克雷伯氏肺炎菌O2-抗原的gal-I抗原结构，优先与gal-III抗原结构结合，例如，与gal-III抗原结合的亲和力高于与gal-I抗原结合的亲和力。根据一个具体实施例，所述抗体与gal-III抗原结合的亲和力比与gal-I抗原结合的亲和力至少大2倍，特别是两者的亲和力与/或亲合力相差至少两倍，或至少三倍，至少四倍，至少五倍，或甚至至少10倍。例如，与gal-I抗原相比，优先与gal-III抗原结合的Kd差至少是0.5或1log，或甚至是至少2log，或至少是3log，采用免疫试验法，优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法测定。特别是，本专利技术抗体的特征还在于其不与任何其它克雷伯氏肺炎菌抗原交叉反应，与/或所述抗体与任何其它克雷伯氏肺炎菌抗原结合的亲和力较低，例如，与其它克雷伯氏肺炎菌抗原(除gal-III或gal-I以外的抗原)相比，优先与gal-III抗原结合的Kd差是至少2log，优选至少3log。特别是，功能活性变体是亲代CDR序列中包含至少一个点突变的功能活性CDR变体，并且包含与亲代CDR序列具有至少60％序列一致性，优选至少70％、至少80％、至少90％序列一致性的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。特定的变体是，例如，所述亲代抗体的人源化变体，其中亲代CDR序列掺入到人或人源化构架序列中，其中每个亲代CDR序列的任选1、2、3或4个氨基酸残基可以通过引入点突变进一步突变，从而改善亲代或人源化抗体的稳定性、特异性和亲和力。特别是，这些变体的VH或重链(HC)序列可以分别被另一个变体的VH和HC序列代替，特别是其中另一变体是同一亲代抗体的任何其它变体。特别是，这些变体的VL或轻链(LC)序列可以分别被另一个变体的VL和LC序列代替，特别是其中另一变体是同一亲代抗体的任何其它变体。特别是，半乳聚糖-III表位被耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌表达，更特别被MDR克隆ST258表达。特别是，半乳聚糖-III表位是耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌的表位。根据一个具体实施例，所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M。亲和力成熟产生的亲代抗体的变体，在此处被称为亲和力成熟变体，其结合亲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O‑抗原结构的半乳聚糖‑III表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖‑III重复单元内，其中所述半乳聚糖‑III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.17 EP 15155448.21.一种特异性识别克雷伯氏肺炎菌脂多糖(LPS)O-抗原结构的半乳聚糖-III表位的分离抗体，所述表位包括在半乳聚糖-III重复单元内，其中所述半乳聚糖-III重复单元是式(I)的支链半乳糖均聚物2.根据权利要求1所述的抗体，相对半乳聚糖-I表位，所述抗体优先与半乳聚糖-III表位结合，或不与半乳聚糖-I表位交叉反应，其中半乳聚糖-I表位包括在克雷伯氏肺炎菌LPSO2a-抗原结构的半乳聚糖-I重复单元中，以及其中半乳聚糖-I重复单元是式(II)的线性半乳糖均聚物3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中半乳聚糖-III表位是耐多药(MDR)克雷伯氏肺炎菌的表位，特别是MDR克隆ST258的表位。4.根据权利要求1至3任一项所述的抗体，所述抗体中和表达半乳聚糖-III表位的克雷伯氏肺炎菌的内毒素，并且所述抗体与半乳聚糖-III表位结合的亲和力Kd小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M。5.根据权利要求1至4任一项所述的抗体，所述抗体是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含带结合位点的至少一个抗体域，所述融合蛋白包含带结合位点的至少一个抗体域，特别是，其中所述抗体是包含随机化或人工氨基酸序列的非天然抗体。6.根据权利要求1至5任一项所述的抗体，所述抗体包含至少一抗体重链可变区(VH)，其特征在于表1所列按照Kabat命名体系命名的CDR1至CDR3序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。7.根据权利要求6所述的抗体，其是A)选自由i)至iv)组员组成的组，其中i)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID1组成的CDR1；和b)由氨基酸序列SEQID2组成的CDR2；和c)由氨基酸序列SEQID3组成的CDR3；ii)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID4组成的CDR1；和b)由氨基酸序列SEQID5组成的CDR2；和c)由氨基酸序列SEQID6组成的CDR3；iii)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID7组成的CDR1；和b)由氨基酸序列SEQID8组成的CDR2；和c)由氨基酸序列SEQID9组成的CDR3；iv)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID10组成的CDR1；和b)由氨基酸序列SEQID11组成的CDR2；和c)由氨基酸序列SEQID12组成的CDR3；或B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，其包含亲代抗体CDR1、CDR2或CDR3中任一个的至少一个功能活性CDR变体。8.根据权利要求6或7所述的抗体，包含选自图2所描述任一VH序列的VH氨基酸序列。9.根据权利要求6至8任一项所述的抗体，所述抗体进一步包含一抗体轻链可变区(VL)，其包含表1所列按照Kabat命名体系命名的CDR4至CDR6序列中的任一个序列，或其功能活性CDR变体。10.根据权利要求9所述的抗体，其是A)选自由i)至iv)组员组成的组，其中i)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID13组成的CDR4；和b)由氨基酸序列SEQID14组成的CDR5；和c)由氨基酸序列SEQID15组成的CDR6；ii)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID16组成的CDR4；和b)由氨基酸序列SEQID17组成的CDR5；和c)由氨基酸序列SEQID18组成的CDR6；iii)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID19组成的CDR4；和b)由氨基酸序列SEQID20组成的CDR5；和c)由氨基酸序列SEQID18组成的CDR6；iv)是一种抗体，包括：a)由氨基酸序列SEQID19组成的CDR4；和b)由氨基酸序列SEQID17组成的CDR5；和c)由氨基酸序列SEQID18组成的CDR6；或B)一种抗体，所述抗体是A中任一组员亲代抗体的功能活性变体，其包含亲代抗体CDR4、CDR5或CDR6中任一个的至少一个功能活性CDR变体。11.根据权利要求10所述的抗体，包含选自图2所描述任一VL序列的VL氨基酸序列。12.根据权利要求6至11任一项所述的抗体，所述抗体包含a)表1所列任何抗体的CDR1-CDR6序列；或b)图2所示任何抗体的VH和VL序列；或c)以a)-c)序列为特征的亲代抗体的功能活性变体，优选其中i.所述功能活性变体包含亲代抗体的任何CDR1-CDR6的至少一个功能活性CDR变体；与/或ii.所述功能活性变体在VH和VL序列的任一序列的构架区包含至少一个点突变；及进一步其中iii.所述功能活性变体具有结合与亲代抗体相同表位的特异性；与/或iv.所述功能活性变体是亲代抗体的人变体、人源化变体、嵌合变体或鼠源变体与/或亲和力成熟变体。13.根据权利要求1至12任一项所述的抗体，包含表1所列任一CDR序列的功能活性CDR变体，其中所述功能活性CDR变体包括以下中的至少一种：a)亲代CDR序列中有1、2或3个点突变；...

【专利技术属性】
技术研发人员：V·西亚尔托，G·纳吉，L·瓜查利亚，Z·维斯拉姆，E·纳吉，J·K·卢卡谢维奇，
申请(专利权)人：阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT