基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法技术

本发明专利技术公开了一种基于原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)的启动子体外强度表征的方法。首先在液体环境中采集得到1000多条启动子‑RNA聚合酶力‑距离曲线，设定10‑40nm的解离距离内最末一个出现的解离事件为单对分子的特异性交互作用事件，采集这些事件的解离力。绘制这些解离力分布图，通过高斯拟合(Gaussian Fitting)分析得到最可能的交互作用力值，并且统计在所有得到的力曲线中，存在符合特异性结合事件的曲线的概率。通过相关性分析，论证了本发明专利技术建立的基于AFM力谱技术结合统计学分析的启动子分析方法的可行性和有效性。

A new method for in vitro strength characterization of Promoters Based on atomic force microscopy

The invention discloses a method based on atomic force microscope (atomic force microscopy, AFM) for in vitro characterization of the promoter strength. First, in the liquid environment acquired more than 1000 promoter RNA polymerase force distance curve, dissociation distance setting 40nm in the last 10 a dissociation event for the specificity of molecular interaction in single event, dissociation force acquisition of these events. Draw the unbinding force distribution, by Gauss fitting (Gaussian Fitting) analysis of interaction between the most likely value, and statistics in all of the force curve, there are specific binding events with probability curve. Through correlation analysis, the feasibility and effectiveness of the promoter analysis method based on AFM force spectrum technique combined with statistical analysis were demonstrated.

【技术实现步骤摘要】
基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法
本专利技术属于生物
，具体是一种基于原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,AFM)的启动子体外强度表征的方法。
技术介绍
在基因表达过程中，启动子是一个重要的顺式调控元件(cis-actingelement)。通过改变启动子强度，调控关键基因的转录水平，精细调节代谢流量的分配，从而实现在追求产物最大积累效率的同时减少细胞代谢负担，成为工业微生物领域的研发热点。近年来，随着代谢工程及合成生物学的发展，以启动子为代表的代谢调控元件的标准化、模块化处理是一大趋势，因此需要高效、精确定量表征启动子活性的策略。目前通过报告基因的表达量来评价启动子活性是比较常用的策略。然而这种分析方法操作繁琐、周期长、易受到菌体生长阶段和生理状态的干扰，最终的表达量还受到其他多重元件的调控，并不能直接体现启动子的调控效果，并且造成不同表达系统之间启动子强度数据无法直接比较的问题。加之受到检测方法的限制，导致定量分析效率低，准确度不高，制约了启动子元件化，标准化的发展。此外，EMSA、体外转录等方法也为我们提供了体外表征启动子活性的选择，但由于其准确度低，操作复杂，需要标记等缺点，并未受到广泛使用。启动子是调控基因转录的重要顺式元件，RNAp通过其σ亚基识别并结合在启动子核心区域的-10以及-35区的保守序列，从而启动转录。启动子与RNAp特异性结合是启动转录的第一步，也是最关键的一步，它们的结合强度决定了转录水平的高低。从分子交互作用的角度考察启动子与RNAp的识别机制，可以为启动子强度的精准量化表征提供新的策略。因此，开发基于分子交互作用的启动子精确定量表征方法具有重大意义，同时可行性较强。利用AFM力谱分析，以原核生物启动子为例，并人工设计关键位点突变的一系列启动子，在体外从多角度分析启动子与RNAp间的交互作用，采集包括结合概率，交互作用力等量化参数。得到的交互作用参数与利用体内报告基因(cat)表达量表征得到的启动子强度进行关联、验证，进而构建基于体外交互作用分析的启动子强度初步筛选方法，为可精准调控启动子元件研究提供新策略。而现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量启动子与RNA聚合酶之间的相互作用力，实现体外基于AFM力谱分析启动子强度的研究目前仍相对缺乏。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,AFM)力谱的启动子体外强度表征的方法。通过采集得到1000多条启动子-RNA聚合酶力-距离曲线，对这些曲线进行统计得到交互作用力值及结合概率。利用R语言结合力、结合概率的参数与传统的启动子强度表征策略-通过报告基因表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性，并具有检测时间短、效率高、步骤少等优点。实现了体外基于AFM力谱分析启动子强度的新方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：首先在液体环境中采集得到1000多条启动子-RNA聚合酶力-距离曲线，设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。接着对这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，分析得到交互作用力值及结合概率。最后通过R语言对所有体外参数与报告基因(cat)表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性。包括以下步骤：1.启动子-RNA聚合酶力-距离曲线采集的具体方法是：在液体环境中采用AFM的接触模式测定了T7启动子与T7RNAp间的交互作用力，并且选择SP6启动子为对照。2.待采集的特异性交互作用力的具体方法是：设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。即在力-距离曲线中，小于10nm距离内出现的交互作用为非特异性事件，不收集数据；而出现在10-40nm之间的交互作用事件会被记录下参数，进行后续的统计分析。3.获得特异性交互作用力的具体方法是：通过对上述的这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，T7启动子与T7RNAp间的交互作用力大小主要集中在100-500pN的范围内，概率分布图满足高斯分布，通过统计分析得到启动子与聚合酶的作用力的大小(结合力分布峰值)即为交互作用力值。4.获得结合概率的具体方法是：存在典型交互作用事件的曲线的数量占样本总量的比例即为结合概率。5.相关性分析的具体方法是：利用R语言计算Pearson相关性系数。而Pearson相关性系数是通过cor()函数可以计算的。相关系数计算的参数可化简为：cor(x,use＝,method＝)，其中x为数据框，use为数据的处理方式，method为指定相关系数类型。计算出来的相关性系数值越接近于1说明相关度越大。6.显著性检验的具体方法是：相关关系计算出来后，需要对其进行统计显著性检验。一般利用cor.test()函数对单个Pearson关系系数进行检验，简化后为：cor.test(x,y,alternative＝,method＝)，其中的x及y为要检验相关性的变量，alternative取值为two.side，method用来指定要计算的相关类型。当计算出来的p值小于或等于0.05时说明相关性具有显著性水平且具有意义。本专利技术的有益效果是：本专利技术建立了一种基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的新方法。首先在液体环境中采集得到1000多条启动子-RNA聚合酶力-距离曲线，设定10-40nm的解离距离内出现的交互作用力为待采集的特异性交互作用力。接着对这些曲线进行统计得到特异性作用力分布图，分析得到交互作用力值及结合概率。最后通过R语言对所有体外参数与报告基因(cat)表达量进行相关性分析，证明了该方法的可行性，并具有检测时间短、效率高、步骤少等优点。本专利技术，对启动子与RNA聚合酶的识别、结合行为进行了全面的体外交互作用分析，并从多角度验证了基于AFM力谱分析是一种体外、高效、定量表征启动子活性的方法具备较强的有效性和可行性。其结果为精准调控启动子元件研究提供新策略。附图说明以下结合附图说明本专利技术的特征和有益效果。图1是基于AFM力谱分析的T7启动子与T7RNA聚合酶的交互作用图：(A)T7/RNAp及SP6/RNAp间测得的作用力频率分布图；(B)T7及SP6启动子与T7RNAp之间的结合概率。图2是突变的T7启动子与T7RNA聚合酶之间的交互作用图：(A)T7-10T/RNAp间测得的作用力频率分布图；(B)T7-10C/RNAp间测得的作用力频率分布图；(C)T7-11T/RNAp间测得的作用力频率分布图；(D)T7-10T、T7-10C及T7-11T启动子与T7RNAp之间的结合概率。具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术进一步说明。实施例1专利技术中AFM探针为金涂覆悬臂探针，原子力显微镜来源于布鲁克DimensionIcon扫描探针显微镜。测体外相互作用所用的启动子序列如下：T7-F：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTTTT-SHC6T7-R：AAAAAATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAT7-10C-F：TAATACGCCTCACTATAGGGAGATTTTTT-SHC6T7-10C-R：AAAAAACTCCCTATAGTGAGGCGTATTAT7-10T-F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的方法，其特征为，在液体环境中采集得到1000多条启动子‑RNA聚合酶力‑距离曲线，设定标准，将采集到的交互作用力‑距离曲线进行筛选，剔除无效曲线，得到仅有特异性交互作用的单分子对力曲线；通过对这些曲线进行分析，采集解离力，统计结合概率，做相关性分析和显著性检验。

【技术特征摘要】
1.一种基于原子力显微镜的启动子体外强度表征的方法，其特征为，在液体环境中采集得到1000多条启动子-RNA聚合酶力-距离曲线，设定标准，将采集到的交互作用力-距离曲线进行筛选，剔除无效曲线，得到仅有特异性交互作用的单分子对力曲线；通过对这些曲线进行分析，采集解离力，统计结合概率，做相关性分析和显著性检验。2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述启动子-RNA聚合酶力-距离曲线采集的具体方法是：在液体环境中采用AFM的接触模式下检测启动子与RNA聚合酶间的交互作用，采集交互作用力-距离曲线。3.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述交互作用力-距离曲线筛选标准是：设定10-40nm的解离距离内出现的最后的交互作用事件为单分子对的特异性交互作用事件。4.如权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓娟，许正宏，张晓梅，史劲松，姚智绚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32