本发明专利技术提供一种针对自噬相关基因Beclin1编码区174‐194位点的siRNA序列，其核苷酸序列是：5’‐GGAGGAAGAGACTAACTCAGG‐3’。本发明专利技术根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为52.4％，对应Beclin1基因编码区的第174‐194位核苷酸。构建针对Beclin1的siRNA真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，能有效抑制Beclin1基因的mRNA和蛋白表达水平，可作为人源细胞自噬水平调控的一个有效靶点。应用于人类细胞自噬水平的调控。
According to the siRNA sequence of autophagy related gene Beclin1 encoding 174 194 loci and its application
The invention provides a method for autophagy related gene Beclin1 encoding region of 174 - 194 loci of siRNA sequences, the nucleotide sequence is 5 'GGAGGAAGAGACTAACTCAGG 3'. According to the design principle of siRNA, cDNA series GC content selection of siRNA is 52.4%, the corresponding Beclin1 gene encoding region of 174th - 194 nucleotide. Construction of siRNA eukaryotic expression vector targeting Beclin1, and transformation of E.coli to extract plasmids and transfect AD293 cells, can effectively inhibit the mRNA and protein expression levels of Beclin1 gene, and can be used as an effective target for the regulation of autophagy level in human cells. Regulation of autophagy in human cells.
【技术实现步骤摘要】
针对自噬相关基因Beclin1编码区174-194位点的siRNA序列及其应用
本专利技术属生物技术，涉及分子生物学和基因工程
，具体涉及针对自噬相关基因Beclin1编码区174-194位点的siRNA序列的设计、筛选及其在调控人类细胞自噬水平中的应用。
技术介绍
自噬(autophagy)是一种程序化的细胞内降解过程，细胞通过包裹降解物形成自噬体运送至溶酶体进行消化，从而满足代谢需要、细胞器更新及维持细胞稳态。根据降解物与溶酶体结合途径的不同，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬三类。其中，对巨自噬的研究最为深入，在此过程中很多自噬相关基因(autophagyrelatedgene,Atg)编码的蛋白定位到自噬前体结构，即双层扁平杯状分隔膜形成的自噬泡。自噬泡伸展变形吞食包裹细胞内老化或损伤的细胞器/蛋白质，形成闭合的双层膜结构，称为自噬体。在细胞骨架驱动下，自噬体的外膜与溶酶体膜融合，内膜及包裹物质进入溶酶体，溶酶体脱颗粒并释放蛋白水解酶降解自噬体，部分降解产物可被细胞再利用。自噬是广泛存在于真核细胞中的生命现象，贯穿于正常细胞的生长发育和生理病理过程。自噬不仅能清除细胞内老化或损伤的细胞器和蛋白质，在维持蛋白质代谢平衡和细胞内环境稳定中起重要作用，而且也与病理性损伤的保护过程相关，对神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物感染等疾病的预防有积极作用。自噬具有高度的进化保守性，其发生、发展受多种Atg基因的调控，至今已鉴定出30多种自噬特异性基因和50多种相关基因。Beclin1基因是酵母自噬基因Atg6在哺乳类动物中的同源基因，是第一个被发现参与自噬过程的基因。其编码的Beclin1蛋白由450个氨基酸组成，包含BH3、卷曲螺旋结构域和进化保守结构域等主要结构域。Beclin1蛋白可调控自噬前体的形成，引导自噬相关蛋白定位于自噬体膜，是整个自噬过程中必不可少的关键分子。Beclin1及其上下游信号调节蛋白组成了重要的自噬调节通路，通常以Beclin1/PI3K3C复合体的形式与各种蛋白相互作用，从而达到调节自噬的目的。近年研究发现Beclin1通过对自噬的调节，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用，是一个重要的抑癌基因。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是序列特异的双链RNA使细胞内同源mRNA降解，从而产生特异性基因表达沉默的过程。RNAi的作用主要由长约21～23nt的小干扰RNA(siRNA)介导，由于RNAi是siRNA靶向作用mRNA引起的特异性降解，因此要产生有效RNAi的关键是选择合适的siRNA作用靶点。RNAi靶点的选择原则主要包括：①从靶基因起始密码子下游50～100nt开始查找；②选择以AA或NA(N代表任意碱基)开始的序列；③选择GC含量在30％-60％左右的mRNA区域；④避免连续的单一碱基和反向重复序列；⑤保证靶序列与其他基因没有同源性。目前，制备siRNA的方法主要包括化学合成法、体外转录法、长片段dsRNA经RNaseⅢ降解法、siRNA表达载体转录法及PCR制备的siRNA表达框法等5种。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种针对自噬相关基因Beclin1编码区174-194位点的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是：5’-GGAGGAAGAGACTAACTCAGG-3’。本专利技术的另一个目的是提供该cDNA序列在人类细胞自噬水平调控中的应用。本专利技术根据siRNA设计原则，选择的siRNA的cDNA序列GC含量为52.4％，对应Beclin1基因编码区的第174-194位核苷酸。构建针对该siRNA的真核表达载体，转化大肠杆菌后提取质粒，转染AD293细胞，能有效抑制Beclin1基因的mRNA水平和蛋白水平，因此可应用于人类细胞自噬水平的调控。本专利技术的有益之处是：提供的siRNA序列针对自噬相关基因Beclin1的编码区，以此序列为基础的真核表达载体在细胞中能持续、有效抑制Beclin1基因的mRNA水平和蛋白水平，故可作为人源细胞自噬水平调控的一个有效靶点。具体实施方式本专利技术通过实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术的范围。实施例1siRNA真核表达载体体外抑制Beclin1-EGFP融合蛋白的表达1.siRNA的设计：根据siRNA设计原则，从Beclin1基因编码区起始密码子ATG下游50nt处搜索NA序列，其3’端相邻21nt序列作为候选靶点，从中选择GC含量在30～60％的siRNA序列，并通过GenBank数据库的Blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。最终选择的siRNA其cDNA序列为5’-GGAGGAAGAGACTAACTCAGG-3’，GC含量为52.4％，对应Beclin1基因编码区的第174-194位核苷酸。2.表达siRNA所需shDNA的合成与制备：表达siRNA所需shDNA的正义链序列为5’-GATCCGGAGGAAGAGACTAACTCAGGTTCGCCTGAGTTAGTCTCTTCCTCCTTTTTA-3’，反义链序列为5’-AGCTTAAAAAGGAGGAAGAGACTAACTCAGGCGAACCTGAGTTAGTCTCTTCCTCCG-3’，委托生物公司合成，将正、反义链分别退火形成双链。3.siRNA真核表达载体的构建：具有U6启动子的真核表达质粒pSilencer2.0-U6用BamHI和HindⅢ双酶切，与退火后的shDNA双链连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜，挑取克隆抽提质粒送生物公司进行DNA测序鉴定，选取测序结果正确的质粒扩增、保存。4.siRNA表达质粒体外抑制Beclin1-EGFP融合蛋白表达的实验(1)融合蛋白质粒pBeclin1-EGFP：为表达绿色荧光蛋白(EGFP)和Beclin1融合蛋白的质粒，由Beclin1基因cDNA插入pEGFP-N1质粒的HindⅢ和EcoRI位点构建而成，由于EGFP位于Beclin1的下游，且共用一个启动子，故EGFP的表达情况可间接反映Beclin1的表达。(2)siRNA表达质粒与融合蛋白质粒共转染AD293细胞：人胚肾细胞AD293接种12孔细胞培养板后，待细胞达到80％～90％融合率，用Invitrogen公司Lipofectamine2000试剂将siRNA表达质粒与融合蛋白质粒pBeclin1-EGFP共转染细胞，操作方法参照试剂说明书，同时设转染空质粒pSilencer2.0-U6的阴性对照组和不转染质粒的空白对照组，5小时后换培养液(含10％新生牛血清的DMEM)继续培养。(3)荧光定量RT-PCR检测AD293细胞中Beclin1基因mRNA的表达：质粒转染后48h，收集AD293细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，采用TAKARA公司的SYBRPrimeScriptRT-RCPKit检测Beclin1基因的mRNA水平，实验方法参照试剂盒说明书。Beclin1基因PCR引物序列为：上游5’-CTGGGGACCTTTTTGACATC-3’，下游5’-TTGCGGTTCTTTTCCACGTC-3’。内参照采用GAPDH，PCR引物序列为：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对自噬相关基因Beclin1编码区174‑194位点的siRNA的cDNA序列，其特征在于，其核苷酸序列是：5’‑GGAGGAAGAGACTAACTCAGG‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种针对自噬相关基因Beclin1编码区174-194位点的siRNA的cDNA序列，其特征在于，其核苷酸序列是：...
【专利技术属性】
技术研发人员：尚世强，陶然，李伟，刘玉洁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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