一种高腈类底物耐受性的腈水解酶产生菌突变体及其选育方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种结合ARTP诱变和OPC‑TCA微量酶反应法高通量筛选腈类底物耐受性提升的产腈水解酶恶臭假单胞菌突变体的方法，属于工业生物技术领域。经OPC‑TCA微量酶反应初筛、摇瓶复筛及传代最终获得一株突变体mut‑D3，在较高底物终浓度为125mM情况下，该菌株的底物耐受性显著提高，同时突变体的腈水解酶酶活是野生菌的1.51倍，经20次传代后酶活仍保持稳定。该突变株能高效转化3‑氰基吡啶合成烟酸，烟酸累积产量相比野生菌明显提高。本发明专利技术完全符合工业化腈水解酶产生菌株的诱变和筛选需要，并可应用于烟酸的生物合成，具有重要的应用价值。

Nitrile hydrolase producing mutant with high nitrile substrate tolerance and its breeding method

The purpose of the invention is to provide a combination of ARTP and OPC TCA mutagenesis trace enzyme reaction method for high throughput screening of nitrile substrate tolerance promotion nitrilase producing Pseudomonas putida mutant method, which belongs to the field of industrial biotechnology. The OPC TCA trace enzyme reaction screening, shake flask and passage eventually get a mutant mut D3, at higher substrate concentration of 125mM and the substrate tolerance of this strain was significantly increased, while the nitrilase mutant enzyme activity is 1.51 times of wild mushrooms, after 20 generations after the enzyme activity remained stable. The mutant strain transformed efficient synthesis of nicotinic acid 3 cyanopyridines, niacin cumulative production compared to the wild bacteria increased significantly. The invention fully meets the requirements of mutagenesis and screening of industrial nitrile hydrolase producing strains, and can be applied to the biosynthesis of nicotinic acid, and has important application value.

【技术实现步骤摘要】
一种高腈类底物耐受性的腈水解酶产生菌突变体及其选育方法
本专利技术属于工业生物
，具体涉及ARTP诱变和高通量筛选方法选育高腈类底物耐受性的恶臭假单胞菌突变体的方法。
技术介绍
烟酸和烟酰胺属于吡啶类化合物，被合称为维生素B3。在人体中，烟酸为脱氢酶的辅酶(NAD+和NADH+)提供碳骨架，而这些辅酶作为电子载体，在体内各种氧化还原反应中发挥重要作用。但人体自身只能转化少量色氨酸生成烟酸，其余必需的量需由食物提供。如果摄入量不足，会导致糙皮病，所以烟酸被广泛用于食品和饲料添加剂，市场需求量极大。此外，烟酸还具有较强的扩张周围血管的作用，可作为药物临床治疗头痛、偏头痛、耳鸣、内耳眩晕症等；烟酸能抑制脂肪动员，使肝中VLDL合成下降，从而降低血浆胆固醇，用于治疗高胆固醇血症。同时，烟酸还能作为医药中间体，用于异烟肼、酰胺、肽胺等的生产。染料工业中，烟酸作为吡啶类化合物也是重要的有机合成中间体。目前，化学法合成烟酸主要存在收率低、副产物多、反应条件剧烈等特点，极大地限制了烟酸的大规模生产。而含腈水解酶的微生物能一步催化3-氰基吡啶生成烟酸，由于过程简便、专一性强、反应条件温和，已经成为近年来烟酸合成的研究热点。但野生菌普遍存在酶活稳定性较差、对底物和产物的耐受性不高、菌体内酶蛋白表达量低等问题。如能有效改善这些问题将有助于绿色化烟酸产业的发展以进一步提升经济效益。ARTP诱变(等离子诱变)是一种新型高效的诱变技术，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间、具有高度活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。ARTP富含的活性能量粒子对菌株/植株/细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，所以能产生大量不同的突变株。此外，ARTP设备操作简单、快速且安全，在工业微生物诱变育种领域中发挥重要作用。如能将基于高通量筛选方法和ARTP的菌种诱变选育技术相结合，则可大幅度提升突变库筛选效率。腈水解酶催化反应中氨和有机酸是等摩尔比生成，采用OPA-TCA微量酶反应，氨能与邻苯二甲醛反应生成无色化合物，该化合物在酸性条件下能生成蓝色可溶性化合物，并且在600nm处具有最大吸光值，可有效应用于腈水解酶产生菌的高通量筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于ARTP诱变和高通量筛选技术选育高腈类底物耐受性的恶臭假单胞菌突变体的方法，采用该方法获得的突变株对底物3-氰基吡啶的耐受性显著提高，相应烟酸产量也随之增加。本专利技术的技术方案是：将恶臭假单胞菌P.putida野生菌进行ARTP诱变，再经后培养以获得稳定的突变株，采用基于96孔板的OPA-TCA微量反应法进行高通量筛选，然后将酶活较高的突变株接种摇瓶进行复筛验证并传代以考察基因稳定性，最终获得高腈类底物耐受性的突变株。具体步骤如下：菌悬液制备：将恶臭假单胞菌野生菌于25-37℃振荡培养20-48h，无菌条件下用生理盐水洗涤和重悬细胞，加入终浓度20％的甘油并稀释调节细胞数至106-108个/mL，制成细胞悬液。ARTP诱变及其致死率绘制：吸取上述10μL细胞悬液均匀涂布于金属载片的上表面。以99.99％氦气作为工作气体，在功率(100W)、气流量(10slm)、工作距离2mm的参数下诱变处理0s、10s、15s、30s、45s、60s、90s、120s、150s、180s。后培养：将带有菌液的金属载片于无菌条件下放入装有新鲜液体培养基的EP管中，25-37℃振荡培养2-5h，稀释菌液并涂布于固体培养基上。后培养所采用的培养基营养要求丰富，培养基配方(g/L)为：蛋白胨5-20、酵母粉5-20、甘油10-30、尿素0.5-5、NaCl0.1-2、磷酸二氢钾1-5、磷酸氢二钾1-5。高腈类底物耐受性突变株的筛选：将突变库中的突变菌编号并挑取至含有500μL新鲜液体培养基的96深孔板中，置于孔板培养箱中25-37℃振荡培养24-48h。离心去上清，每孔加入磷酸钠缓冲液(100mM,pH7.2)洗涤并重悬，制成900μL菌悬液。加入100μL3-氰基吡啶溶液(终浓度125mM)，30℃振荡反应10min，离心终止反应。分别吸取10μL反应上清液至含100μLOPA试剂(20mM)的新96孔微孔板中，20℃振荡反应20min，加入100μLDMSO溶解，再加入50μLTCA试剂显色，于600nm下测定吸光度。复筛：将初筛中酶活较高的突变菌接种至50mL液体培养基中，25-37℃振荡培养24-48h。取适量200μL菌液测定酶活。传代：将初筛和复筛中表现优异的正突变在固体培养基中传代20次以考察基因稳定性。批次转化：将突变株接种至50mL液体培养基中，25-37℃振荡发酵24-48h，离心去上清，用磷酸钠缓冲液(100mM、pH7.2)洗涤重悬，制成50mL菌悬液。采用批次转化模式加入底物3-氰基吡啶于30℃振荡反应，通过HPLC检测烟酸和3-氰基吡啶含量，HPLC条件如下，仪器：戴安Ultimate3000系列HPLC、色谱柱：AtlantisdC18(5μm，4.6×150mm；Waters，USA)、流动相：乙腈：水＝3:2(含0.02％三氟乙酸)、流速：0.5mL/min、检测波长：268nm、柱温：30℃、进样量：10μL。考察不同3-氰基吡啶浓度对烟酸产率的影响：分别选取50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM作为3-氰基吡啶投料浓度。有益效果：与现有筛选方法比，本专利技术提供了一种结合ARTP诱变和OPC-TCA微量酶反应法高通量筛选腈类底物耐受性提升的产腈水解酶恶臭假单胞菌突变体的方法，本专利技术还获得一株底物耐受性及酶活显著提高的突变株mut-D3，该菌株能转化累积获得189g/L烟酸，烟酸产量相比于野生菌提高42.11％。附图说明图1Pseudomonasputida的ARTP诱变致死率曲线图2氨标准曲线图3Pseudomonasputida野生菌在96深孔板中生长曲线和酶活曲线图4Pseudomonasputida突变株mut-D3的初筛图5Pseudomonasputida突变株的复筛和突变株mut-D3的传代图6野生菌和mut-D3的批次转化图7不同3-氰基吡啶浓度对烟酸产率的影响和批次转化具体实施方法为了进一步介绍本专利技术，下面结合附图进行详细说明。实施例1：腈水解酶产生菌的ARTP诱变育种制作OD600-细胞个数曲线：接种P.putida接种于50mL液体培养基中，30℃振荡培育至14、16、18、20、22、24、26、28h，分别取200μL菌液稀释测定OD600。取100μL菌液梯度稀释，取50μL适宜稀释度下的稀释液涂布平板，待菌落长出即可计数。致死率曲线绘制：将P.putida接种于液体培养基，于30℃振荡培养24h至对数生长期。无菌条件下用生理盐水洗涤和重悬细胞，加入终浓度20％的甘油并稀释调节细胞数至106-108个/mL。吸取上述10μL细胞悬液均匀涂布于金属载片的上表面。以99.99％氦气作为工作气体，在功率(100W)、气流量(10slm)、工作距离2mm的参数下诱变处理0s、10s、15s、30s、45s、60s、90s、120s、150s、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高腈类底物耐受性的腈水解酶产生菌突变体，命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida mut‑D3，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路一号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14276，保藏日期为2017年6月26日。

【技术特征摘要】
1.一株高腈类底物耐受性的腈水解酶产生菌突变体，命名为恶臭假单胞菌Pseudomonasputidamut-D3，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路一号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.14276，保藏日期为2017年6月26日。2.一种高腈类底物耐受性的腈水解酶产生菌突变体的ARTP诱变及其高通量筛选的方法，其特征在于，制备CGMCCNo.14276菌悬液并稀释调节细胞数至106-108个/mL，将菌悬液采用ARTP诱变，处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚劲松，许正宏，董婷婷，史劲松，李恒，窦文芳，蒋敏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32