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一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法与应用技术

技术编号:16585517 阅读:184 留言:0更新日期:2017-11-18 13:33
本发明专利技术公开了一种检测CP4‑EPSPS蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法和应用,基底电极表面依次经AuNPs‑CMK‑3分散液修饰,EDC和NHS的混合溶液活化,CP4‑EPSPS抗体和硫堇的混合溶液共价结合处理。所述基底电极为玻碳电极,所述CP4‑EPSPS抗体为纳米抗体。本发明专利技术的电化学免疫传感器具有灵敏度高、特异性强、仪器轻便易携带等明显优势,可以在生物大分子的检测方面发挥重要作用,具有广泛的应用前景。

A detection of CP4 EPSPS protein electrochemical immunosensor and its preparation method and Application

The invention discloses a method for detection of CP4 EPSPS protein electrochemical immunosensor and its preparation method and the application of surface electrode substrate by using AuNPs CMK 3 Dispersion modification, mixed solution of EDC and the activation of NHS, CP4 covalent EPSPS antibody and thionine solution combined treatment. The base electrode for glassy carbon electrode, the CP4 EPSPS antibody for nano antibody. The electrochemical immunosensor of the present invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, portability and portability of the instrument, and can play an important role in the detection of biological macromolecules, and has wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法与应用
本专利技术属于CP4-EPSPS蛋白快速检测
,具体涉及一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法与应用。
技术介绍
EPSPS(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)是莽草酸途径中的一个关键酶,广泛存在于植物及微生物中,并且是广普高效除草剂草甘膦的靶标酶,而CP4-EPSPS对草甘膦具有非常高的抗性,因此被广泛应用于农作物转基因工程中。自1996年首批转基因抗草甘膦大豆40-3-2商业化以来,抗草甘膦作物的种植面积迅速增长。面对大量含有CP4-EPSPS的转基因农作物,我们迫切地需要建立科学灵敏的检测方法对其进行定性定量检测。目前,检测CP4-EPSPS蛋白的方法主要有酶联免疫吸附法、多重实时PCR法、蛋白质印迹法等。但这些方法操作较繁琐,比如引物的制备、质粒的提取等,仪器较昂贵,且对操作人员的技术要求高。因此建立一种更加便捷灵敏高效地检测方法仍然非常必要。电化学免疫传感器作为一种新型检测平台,以其鉴定物质的高度特异性、敏感性和稳定性受到青睐,它的问世使传统的免疫分析发生了很大的变化。它将传统的免疫测试和生物传感技术融为一体,集两者的诸多优点于一身,不仅减少了分析时间、提高了灵敏度和测试精度,也使得测定过程变得简单,易于实现自动化,有着广阔的应用前景。另外,纳米抗体是一种从骆驼血液中提取的具有完整功能的最小抗原结合片段,分子量仅有15kDa,具有可溶性高,不易聚集,能耐高温、强酸、强碱等致变性条件等诸多优于传统抗体的特点。而目前,尚未有技术利用纳米抗体构建电化学免疫传感器实现对CP4-EPSPS蛋白的高效检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于纳米金介孔碳(AuNPs-CMK-3)和纳米抗体的电化学免疫传感器及其制备方法,通过该方法实现对CP4-EPSPS蛋白高灵敏度高特异性的定性定量检测。本专利技术中技术术语的缩写如下:玻碳电极:GCE;纳米金介孔碳:AuNPs-CMK-3;介孔碳:CMK-3;纳米金颗粒:AuNPs;硫堇:Th;纳米抗体:Nb。为实现上述目的,本专利技术的技术方案如下:一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法,基底电极表面依次经AuNPs-CMK-3分散液修饰,EDC和NHS的混合溶液活化,CP4-EPSPS抗体和硫堇的混合溶液共价结合。所述基底电极为玻碳电极。玻碳电极长8cm,有效导电面积直径为3mm。所述AuNPs-CMK-3分散液按如下步骤制备得到:(1)AuNPs的制备取HAuCl4溶液在冷凝回流装置中加热煮沸,在搅拌条件下向其加入柠檬酸钠溶液作为还原剂,继续搅拌10~30min,至颜色变为橙红色,撤去加热源逐渐冷却至室温,得到AuNPs溶液;(2)AuNPs-CMK-3的制备称取CMK-3加入AuNPs溶液中,室温下充分搅拌反应4~6h后,将混悬液真空抽滤,收集所得的AuNPs-CMK-3真空干燥;称量上述干燥复合物溶于DMF溶液中,得到AuNPs-CMK-3分散液。所述步骤(1)中HAuCl4.3H2O溶液的溶剂为去离子水,浓度为0.12mg/mL;柠檬酸钠溶液的溶剂为去离子水,浓度为38.8mM,HAuCl4和柠檬酸钠的质量比为1:2.375。所述步骤(1)中HAuCl4和步骤(2)中CMK-3的质量比为1~4:5。优选地,所述步骤(1)中HAuCl4和步骤(2)中CMK-3的质量比为2:5。所述CP4-EPSPS抗体为CP4-EPSPS纳米抗体。一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:(1)滴加AuNPs-CMK-3分散液:取AuNPs-CMK-3分散液,滴加于经过处理的基底电极表面,室温下放置12~24h;(2)活化AuNPs-CMK-3:将步骤(1)得到的电极用去离子水清洗,晾干,滴加EDC和NHS的混合溶液于电极表面,室温放置1~2h;(3)共价连接抗体和信号探针分子:将步骤(2)得到的电极用去离子水清洗,晾干,滴加CP4-EPSPS纳米抗体和硫堇的混合溶液,2~4℃放置10~12h;(4)封闭非特异性位点:将步骤(3)得到的电极用去离子水清洗,晾干,滴加BSA溶液室温放置10~40min。其中,基底电极用粒径为0.3μm和0.05μm的氧化铝粉依次进行抛光处理,然后用乙醇和去离子水清洁电极,此步骤在超声清洗器中操作。所述步骤(1)中AuNPs-CMK-3分散液的浓度为0.5mg/mL。AuNPs-CMK-3分散液是过量的,用去离子水清洗未结合的AuNPs-CMK-3。所述步骤(2)中EDC和NHS的混合溶液,溶剂为0.1MPBS,EDC的浓度为20mg/mL,NHS的浓度为10mg/mL,EDC和NHS的质量比为2:1。EDC和NHS的混合溶液是过量的,用去离子水清洗未结合的EDC和NHS。所述步骤(3)中CP4-EPSPS抗体和硫堇的混合溶液,溶剂为0.1MPBS,CP4-EPSPS抗体的浓度为10μg/mL,硫堇的浓度为0.1mg/mL。CP4-EPSPS抗体和硫堇的混合溶液是过量的,用去离子水清洗未结合的CP4-EPSPS和硫堇。所述步骤(4)中BSA溶液的溶剂为0.1MPBS,浓度为10mg/mL。BSA溶液是过量的。至此,一个基于AuNPs-CMK-3和纳米抗体Nb的电化学免疫传感器构建完成,它的组装顺序如下:通过查找借助该传感器绘制的抗原浓度对数与信号探针电流衰减比率之间关系的标准曲线图,该平台可以检测到对应抗原浓度的大小。上述制备方法制备得到的电化学免疫传感器。上述制备方法制备得到的电化学免疫传感器在定量检测CP4-EPSPS蛋白中的应用。有益效果:相对于现有技术,本专利技术的优势如下:1、本专利技术通过设计和调控纳米金的质量,制备最佳质量比纳米金介孔碳复合物(AuNPs-CMK-3),使其发挥最佳的信号增强作用;本专利技术中引入硫堇作为信号探针分子,硫堇作为经典的氧化还原活性分子,具有非常可靠的电化学活性。2、本专利技术利用纳米抗体作为捕获抗体,使免疫传感器的检测性能更加稳定和可靠。3、本专利技术电化学免疫传感器具有灵敏度高、特异性强、仪器轻便易携带等明显优势,可以在生物大分子的检测方面发挥重要作用,具有广泛的应用前景。附图说明图1为AuNPs-CMK-3增强信号的循环伏安图;图2为孵育待测抗原前后的差分脉冲伏安图;图3为抗原浓度与电流衰减比率之间的线性关系图;图4为本专利技术电化学免疫传感器的特异性图。具体实施方式根据下述实施例,可以更好地理解本专利技术。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。CP4-EPSPS纳米抗体及其抗原由中国科学院上海药物研究所万亚坤研究组提供,制备方法在专利申请号201510048148.7中公开。实施例1AuNPs-CMK-3的制备(1)AuNPs的制备取100mL浓度为0.12mg/mL的HAuCl4溶液在冷凝回流装置中加热煮沸,在搅拌条件下向其加入2.5mL38.8mMC6H5Na3O7.2H2O溶液作为还原剂,继续搅拌加热15min后,颜色变为橙红色,撤去加热源逐渐冷却至室温,得到AuNPs溶液。(2)AuN本文档来自技高网
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一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器及其制备方法与应用

【技术保护点】
一种检测CP4‑EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,基底电极表面依次经AuNPs‑CMK‑3分散液修饰,EDC和NHS的混合溶液活化,CP4‑EPSPS抗体和硫堇的混合溶液共价结合。

【技术特征摘要】
1.一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,基底电极表面依次经AuNPs-CMK-3分散液修饰,EDC和NHS的混合溶液活化,CP4-EPSPS抗体和硫堇的混合溶液共价结合。2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述基底电极为玻碳电极。3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述AuNPs-CMK-3分散液按如下步骤制备得到:(1)取HAuCl4溶液在冷凝回流装置中加热煮沸,在搅拌条件下向其中加入柠檬酸钠溶液作为还原剂,继续搅拌加热10~30min后,撤去加热源冷却至室温,得到AuNPs溶液;(2)称取CMK-3加入步骤(1)得到的AuNPs溶液中,室温下搅拌反应4~6h后,将得到的混悬液真空抽滤,收集得到的AuNPs-CMK-3进行干燥;将干燥的AuNPs-CMK-3溶于DMF中,得到AuNPs-CMK-3分散液。4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中HAuCl4和柠檬酸钠的质量比为1:2.375。5.根据权利要求3所述的制备方法,其特...

【专利技术属性】
技术研发人员:沈艳飞张明明潘登陈慧琴张袁健
申请(专利权)人:东南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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