一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用技术

技术编号:16498286 阅读:34 留言:0更新日期:2017-11-04 10:37
一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。目前在鱼中发现了3种XCR1样趋化因子受体,即XCR1、XCR1L和CCR12,其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现,但关于其功能研究甚少,截止目前,尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道,尚未有人制备过斜带石斑鱼的CCR12多克隆抗体,关于CCR12多克隆抗体的应用更无任何报道。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况,鉴定CCR12阳性细胞类型,本研究首次通过原核系统表达纯化了CCR12的N‑端区和3个胞外区重组蛋白,并最终首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体,该抗体能特异性识别石斑鱼CCR12蛋白,且标记血液中的细胞,为我们今后标记CCR12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。

Polyclonal antibody preparation method and application of grouper CCR12

Polyclonal antibody preparation method and application of grouper CCR12. The fish found 3 XCR1 chemokine receptors, namely XCR1, XCR1L and CCR12, XCR1L and CCR12 were only found in the fish genome, but little research on its function, until now, there has not been any reports about the expression of CCR12 in fish, has not yet been prepared grouper the application of CCR12 polyclonal antibody, CCR12 polyclonal antibody but no reports. In order to further reveal the grouper CCR12 positive cells in the parasite in infected tissues migration or proliferation, positive cell type identification CCR12, this is the first study through prokaryotic expression of CCR12 N zone and 3 extracellular domain recombinant protein was purified, and finally for the first time, Rabbit anti CCR12 recombinant protein to prepare polyclonal antibody, the the antibody can specifically recognize the grouper CCR12 protein, and the labeled cells in the blood, for our future markers of CCR12 positive cells and carry out the anti parasite infection of foundation.

【技术实现步骤摘要】
一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用
本专利技术属于生物工程
,具体涉及一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。
技术介绍
趋化因子是一类分子量非常小的细胞因子,他们具有相似的单体结构(Baggiolini,1998;Jinetal.,2005)。根据其结构和4个保守半胱氨酸的排列顺序,可将趋化因子分为:CXC型、CC型、XC型、CX3C型和CX型等5类(Murphy,etal.,2000;Nomiyamaetal.,2008)。趋化因子行使功能时,需要与其相应的受体结合。XCL1是一种XC型趋化因子,在稳态、病原感染或炎症反应时,由胸腺髓样上皮细胞、或激活的T细胞、NK细胞、以及NKT细胞产生(Leietal.,2012)。XCR1是XCL1唯一的受体,由CD8α+和CD11b-CD103+DC细胞分泌(Alexandreetal.,2013)。XCL1-XCR1轴在维持内稳态、调节性T细胞产生、以及DC细胞介导的细胞毒性反应中都起到重要作用(Leietal.,2012)。此外,XCL1-XCR1轴还参与感染和自生免疫疾病。目前,鼠基因组中只鉴定到XCL1这一种趋化因子XC亚家族成员,但在人基因组中鉴定到XCL1和XCL2两种(DeVriesetal.,2006;Foxetal.,2015)。XCL1是哺乳动物和鸟中普遍存在的趋化因子,但XCL2仅仅在一些物种中存在(Nomiyamaetal.,2011)。在鱼中,目前尚未鉴定到XCL1或XCL2同源蛋白,但发现了3种XCR1样趋化因子受体,即XCR1、XCR1L和CCR12(Grimholtetal.,2015;Nomiyamaetal.,2011)。其中XCR1L和CCR12只在鱼类基因组中发现,但关于其功能研究甚少,且抗XCR1L或CCR12抗体的缺乏也限制了对其阳性细胞的分离及功能的研究。截止目前,尚未有关于鱼类CCR12体外表达的任何报道,更无关于CCR12多克隆抗体的研究。我们研究发现:刺激隐核虫感染后,石斑鱼CCR12在皮肤、鳃和脾脏中的表达量显著增加,推测CCR12阳性细胞参与石斑鱼抗寄生虫感染过程。为进一步揭示石斑鱼CCR12阳性细胞在寄生虫感染组织中的迁移或增殖情况,鉴定CCR12阳性细胞类型,本研究首次构建了石斑鱼CCR12胞外区表达载体,首次通过原核系统表达纯化了CCR12的N-端区和3个胞外区重组蛋白,并最终首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体,该抗体能特异性识别石斑鱼CCR12蛋白,且标记血液中的细胞,为我们今后标记CCR12阳性细胞并开展其抗寄生虫感染研究奠定基础。
技术实现思路
到目前为止,尚未有人制备过斜带石斑鱼的CCR12多克隆抗体,关于CCR12多克隆抗体的应用更无任何报道,而本专利技术通过基因工程方法,首次成功表达纯化了斜带石斑鱼CCR12,并首次制备了兔抗CCR12重组蛋白多克隆抗体,同时对其初步应用也进行了一定研究。本专利技术的目的在于提供一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用,具体步骤如下:(一)石斑鱼CCR12基因克隆及序列分析:1、石斑鱼脾脏总RNA的提取(1)从液氮中快速取出冻存的脾脏,进行液氮研磨,待研磨充分后,加入3mlTRIzolReagent,待其快融化时,吸1ml至1.5mlEP管中,冰上放置;(2)每管中加入20%氯仿(即1mlTRIzolReagent加入0.2ml氯仿),剧烈震荡15s,冰上静置3min可看到分层现象;(3)4℃,12000g离心15min,管中液体分为三层,从上到下依次为水层、蛋白质层、有机层,吸取上清至一新的1.5mlEP管中;(4)向管中加入0.5ml异丙醇,轻轻倒转EP管,冰上静置10min;(5)4℃,12000g离心10min,弃上清(不要连续倒转);(6)每管中加入1ml75%乙醇(用DEPC水配制),用枪头轻轻吹起沉淀;(7)4℃,7500g离心5min,去上清;(8)重复(6)、(7)步骤一次;(9)用15μlRNase-free水溶解RNA;(10)用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度,用核酸浓度测定仪测RNA的浓度,A260/A280显示其纯度,剩余样品-70℃放置待用。2、一链cDNA的合成先去除基因组DNA污染,再反转录为一链cDNA。按照下表1添加各组分,轻轻混匀,短暂离心;表1去除基因组DNA污染配方(1)PCR仪37℃孵育30min以去除基因组DNA污染;(2)加入1μl50mMEDTA,65℃孵育10min灭活DNaseI;(3)每微克总RNA加入1μlOligo(dT)20(10pmol/μl),65℃孵育5min后立即放于冰上以消除RNA的二级结构,提高逆转率的效率;(4)按下表2配制逆转录反应体系,反应程序为:42℃、30min,99℃、5min,4℃、5min。产物-20℃待用。表2反转录为cDNA配方3、CCR12序列的扩增根据石斑鱼转录组信息,将编码CCR12的contig放到NCBI上查找ORF区,并进行序列比对,在ORF区外侧设计引物(表3),以上一步骤获得的脾脏cDNA为模板PCR扩增目的基因的ORF区。表3基因克隆引物PCR扩增反应液的配方如下表4所示。PCR反应条件为:98℃,1min,(98℃,10s;55℃,15s;72℃,1min)35个循环,最后72℃终延伸10min。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。表4PCR扩增体系配方4、目的片段的胶回收目的片段PCR产物的回收和纯化按照如下步骤:(1)在紫外灯下照胶,并尽可能快的切下目的条带放置于一新的已称重的1.5mlEP管中;(2)给EP管称重,计算胶体的质量和体积(胶体的体积按照1ml/g计算);(3)按照1倍体积的凝胶体积加入BindingBuffer(XP2)并置于60℃水浴锅中孵育直至凝胶全部溶解,期间间隔2-3min轻轻混匀凝胶溶解液;(4)将试剂盒中的DNAMiniColumn与2mlCollectionTube配套放好;(5)将(3)中的溶解液转移至MiniColumn中,室温10000g离心1min;(6)去除流出液并重复(5)直至所有的凝胶溶解液都经MiniColumn底部的滤膜离心过滤;(7)向MiniColumn中加入300μlBindingBuffer(XP2),室温13000g离心1min,去流出液;(8)向MiniColumn中加入700μlSPWWashBuffer,室温13000g离心1min,去流出液;(9)重复步骤(8)一次;(10)室温13000g离心2min使空的MiniColumn的滤膜尽量脱水;(11)将MiniColumn放置于一新的1.5mlEP管中,加入15-30μlElutionBuffer于滤膜中央,室温静置1min后,室温13000g离心1min洗脱DNA;(12)将上述1.5mlEP管于-20℃保存。5、目的片段的克隆与转化按照表5体系进行加样:表5平末端载体连接试剂盒使用配方(1)25℃连接30min;(2)将连接产物加至50μlDH5α感受态(克隆菌)中,冰浴30min;(3)42℃水浴热激90s,冰浴2min;(4)加入1ml新鲜LB本文档来自技高网
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一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用

【技术保护点】
一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用,其特征在于,步骤如下:(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化:I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增;a.通过SMART软件分析,斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白,由一个N‑端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C‑端区构成;选择斜带石斑鱼CCR12的N‑端区和3个胞外区进行扩增;b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物,以前面合成的cDNA为模板,用高保真酶PrimeSTAR

【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用,其特征在于,步骤如下:(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化:I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增;a.通过SMART软件分析,斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白,由一个N-端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C-端区构成;选择斜带石斑鱼CCR12的N-端区和3个胞外区进行扩增;b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物,以前面合成的cDNA为模板,用高保真酶PrimeSTARTMMix分别扩增CCR12的N-端区和3个胞外区;c.再以CCR12NF/EL1R为引物,步骤b扩增的CCR12N-端区和第1个胞外区为模板,通过重组PCR连接N-端区和第1个胞外区;同时,以CCR12EL2F/EL3R为引物,以步骤b扩增的CCR12的第2和第3个胞外区为模板,通过重组PCR连接第2和第3个胞外区;d.最后,以CCR12NF/EL3R为引物,以步骤c连接成功的两个融合片段为模板,通过重组PCR将CCR12的N-端区和3个胞外区连接到一起,胶回收目的片段。其中,引物CCR12NF的序列为CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT,引物CCR12NR的序列为AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG,扩增片段为41bp;引物CCR12EL1F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG,引物CCR12EL1R的序列为AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC,扩增片段为87bp;引物CCR12EL2F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA,引物CCR12EL2R的序列为GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA,扩增片段为135bp;引物CCR12EL3F的序列为GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC,引物CCR12EL3R的序列为CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT,扩增片段为96bp;引物序列中下划线部分表示酶切位点。(2)表达载体的提取;(3)双酶切目的片段和表达载体;(4)重组表达载体构建:通过菌落PCR法鉴定阳性克隆,并进行测序;II、CCR12重组蛋白表达条件的优化(1)CCR12重组蛋白的诱导表达;(2)重组蛋白表达条件的优化;a.IPTG浓度的优化;b.诱导时间的优化。III、CCR12重组蛋白的纯化;(二)斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备:I、CCR12多克隆抗体制备:(1)将两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周;(2)取约2mg重组蛋白,加入PBS至2ml,加入2ml弗氏完全佐剂,反复推拉共轭注射器使重组蛋白乳化;(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白,对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75%酒精棉消毒),注射剂量为1ml/只;(4)两周后,进行加强免疫,以初始免疫一半重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后,对新西兰雄兔进行皮下注射,共加强免疫3次,每次间隔时间均为2周;(5)最后一次加强免疫7天后,对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血,室温静置2h,4℃过夜,4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清,56℃处理30min以灭活补体,用proteinA柱子进行纯化,分装后-20℃保存。II、ELISA测定多抗效价;III、Westernblotting检测多抗的特异性:(1)提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白;(2)多抗的特异性检测:a.抗原蛋白SDS-PAGE电泳后...

【专利技术属性】
技术研发人员:但学明李言伟周玲
申请(专利权)人:华南农业大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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