Polyclonal antibody preparation method and application of grouper CCR12. The fish found 3 XCR1 chemokine receptors, namely XCR1, XCR1L and CCR12, XCR1L and CCR12 were only found in the fish genome, but little research on its function, until now, there has not been any reports about the expression of CCR12 in fish, has not yet been prepared grouper the application of CCR12 polyclonal antibody, CCR12 polyclonal antibody but no reports. In order to further reveal the grouper CCR12 positive cells in the parasite in infected tissues migration or proliferation, positive cell type identification CCR12, this is the first study through prokaryotic expression of CCR12 N zone and 3 extracellular domain recombinant protein was purified, and finally for the first time, Rabbit anti CCR12 recombinant protein to prepare polyclonal antibody, the the antibody can specifically recognize the grouper CCR12 protein, and the labeled cells in the blood, for our future markers of CCR12 positive cells and carry out the anti parasite infection of foundation.
【技术实现步骤摘要】
一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用
本专利技术属于生物工程
,具体涉及一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用。
技术介绍
趋化因子是一类分子量非常小的细胞因子,他们具有相似的单体结构(Baggiolini,1998;Jinetal.,2005)。根据其结构和4个保守半胱氨酸的排列顺序,可将趋化因子分为:CXC型、CC型、XC型、CX3C型和CX型等5类(Murphy,etal.,2000;Nomiyamaetal.,2008)。趋化因子行使功能时,需要与其相应的受体结合。XCL1是一种XC型趋化因子,在稳态、病原感染或炎症反应时,由胸腺髓样上皮细胞、或激活的T细胞、NK细胞、以及NKT细胞产生(Leietal.,2012)。XCR1是XCL1唯一的受体,由CD8α+和CD11b-CD103+DC细胞分泌(Alexandreetal.,2013)。XCL1-XCR1轴在维持内稳态、调节性T细胞产生、以及DC细胞介导的细胞毒性反应中都起到重要作用(Leietal.,2012)。此外,XCL1-XCR1轴还参与感染和自生免疫疾病。目前,鼠基因组中只鉴定到XCL1这一种趋化因子XC亚家族成员,但在人基因组中鉴定到XCL1和XCL2两种(DeVriesetal.,2006;Foxetal.,2015)。XCL1是哺乳动物和鸟中普遍存在的趋化因子,但XCL2仅仅在一些物种中存在(Nomiyamaetal.,2011)。在鱼中,目前尚未鉴定到XCL1或XCL2同源蛋白,但发现了3种XCR1样趋化因子受体,即XCR1、XCR1L和CC ...
【技术保护点】
一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用,其特征在于,步骤如下:(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化:I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增;a.通过SMART软件分析,斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白,由一个N‑端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C‑端区构成;选择斜带石斑鱼CCR12的N‑端区和3个胞外区进行扩增;b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物,以前面合成的cDNA为模板,用高保真酶PrimeSTAR
【技术特征摘要】
1.一种斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备方法及其应用,其特征在于,步骤如下:(一)石斑鱼CCR12的原核表达及纯化:I、CCR12重组表达载体的构建(1)目的片段扩增;a.通过SMART软件分析,斜带石斑鱼CCR12是一种七次跨膜蛋白,由一个N-端区、3个胞外区、3个胞内区和一个C-端区构成;选择斜带石斑鱼CCR12的N-端区和3个胞外区进行扩增;b.以CCR12NF/R、CCR12EL1F/R、CCR12EL2F/R和CCR12EL3F/R为引物,以前面合成的cDNA为模板,用高保真酶PrimeSTARTMMix分别扩增CCR12的N-端区和3个胞外区;c.再以CCR12NF/EL1R为引物,步骤b扩增的CCR12N-端区和第1个胞外区为模板,通过重组PCR连接N-端区和第1个胞外区;同时,以CCR12EL2F/EL3R为引物,以步骤b扩增的CCR12的第2和第3个胞外区为模板,通过重组PCR连接第2和第3个胞外区;d.最后,以CCR12NF/EL3R为引物,以步骤c连接成功的两个融合片段为模板,通过重组PCR将CCR12的N-端区和3个胞外区连接到一起,胶回收目的片段。其中,引物CCR12NF的序列为CGGGATCCATGAGCGACGAATTTCTGCT,引物CCR12NR的序列为AGAACCACCGCCGCCAAATTTCGCACCAAAGTGG,扩增片段为41bp;引物CCR12EL1F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTCATCTGTCTGAATGG,引物CCR12EL1R的序列为AGAACCACCGCCGCCGTAGGCACTGCTGAC,扩增片段为87bp;引物CCR12EL2F的序列为GGCGGCGGTGGTTCTAAAAATGTGGGTAGCA,引物CCR12EL2R的序列为GCTGCCACCGCCACCGAATTGCTGGTAATA,扩增片段为135bp;引物CCR12EL3F的序列为GGTGGCGGTGGCAGCGCTATTCAGATCTC,引物CCR12EL3R的序列为CCGCTCGAGTCACGCATAGTCCAAGCTCT,扩增片段为96bp;引物序列中下划线部分表示酶切位点。(2)表达载体的提取;(3)双酶切目的片段和表达载体;(4)重组表达载体构建:通过菌落PCR法鉴定阳性克隆,并进行测序;II、CCR12重组蛋白表达条件的优化(1)CCR12重组蛋白的诱导表达;(2)重组蛋白表达条件的优化;a.IPTG浓度的优化;b.诱导时间的优化。III、CCR12重组蛋白的纯化;(二)斜带石斑鱼CCR12的多克隆抗体制备:I、CCR12多克隆抗体制备:(1)将两只新西兰雄兔在无菌动物房适应饲养2周;(2)取约2mg重组蛋白,加入PBS至2ml,加入2ml弗氏完全佐剂,反复推拉共轭注射器使重组蛋白乳化;(3)用无菌注射器吸取已与弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白,对新西兰雄兔分多个位点进行皮下注射(注射位点需先用75%酒精棉消毒),注射剂量为1ml/只;(4)两周后,进行加强免疫,以初始免疫一半重组蛋白量与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀后,对新西兰雄兔进行皮下注射,共加强免疫3次,每次间隔时间均为2周;(5)最后一次加强免疫7天后,对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血,室温静置2h,4℃过夜,4℃、4000r/min离心30min后小心吸取上层血清,56℃处理30min以灭活补体,用proteinA柱子进行纯化,分装后-20℃保存。II、ELISA测定多抗效价;III、Westernblotting检测多抗的特异性:(1)提取斜带石斑鱼头肾的总蛋白和膜蛋白;(2)多抗的特异性检测:a.抗原蛋白SDS-PAGE电泳后...
【专利技术属性】
技术研发人员:但学明,李言伟,周玲,
申请(专利权)人:华南农业大学,
类型:发明
国别省市:广东,44
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