一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，属于生物技术领域，本发明专利技术方法包括以下步骤：（1）免疫动物；（2）血清采集、稀释；（3）支原体‑血清结合、培养；（4）结果判定。本发明专利技术使用血清学方法替代动物试验，操作简单，技术要求低，重复性强，特异性好，该方法的建立避免了免疫攻毒保护法结果判定的主观性，避免散毒，适用于普遍推广。

Potency test method of Mycoplasma vaccine

The invention discloses a chicken poison Mycoplasma vaccine potency determination method, belongs to the field of biotechnology, the method of the invention comprises the following steps: (1) immune animal; (2) serum collection and dilution; (3), combined with serum mycoplasma culture; (4) the results of judgment. The present invention using serological methods alternatives to animal testing, simple operation, low technical requirements, strong repeatability, good specificity, this method avoids the subjectivity of the immune toxicity protection law result, to avoid spreading poison, suitable for popularization.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法
本专利技术涉及一种疫苗效力的测定方法，尤其是一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，属于生物

技术介绍
鸡毒支原体病是由鸡毒支原体（MG）感染引起的鸡、火鸡慢性呼吸道病（CRD），临床上主要表现为咳嗽、流鼻涕，呼吸时有啰音，严重时张口呼吸等症状，感染鸡剖检经常可见气囊炎和窦炎症状。据有关报道，MG感染鸡群后，雏鸡、蛋鸡、肉鸡的生产性能均会受到不同程度的影响，且其造成的免疫抑制极易引起其他疾病的继发或伴发感染，成为危害养鸡业的重要疾病之一。有效的疫苗免疫是预防鸡毒支原体感染的重要手段。目前鸡毒支原体疫苗效力测定方法主要是免疫攻毒保护法，根据攻毒后鸡气囊病变积分情况进行结果判定。上述试验的实施需要有负压的工作环境，每次都需要剖杀试验鸡，且评价结果时受主观因素的影响较大，以致经常会造成检验结果的误差；同时强毒攻击也存在生物安全隐患，易散毒；在实际工作中还受个体、环境、饲养等因素的影响，重复性差，为疫苗效力的研究带来诸多的困难。本专利技术方法可替代免疫攻毒保护法，结果客观、重复性强、操作简单，更适于实际临床应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷、提供一种新型的鸡毒支原体疫苗效力测定方法，以提高检测精确度，缩短检测周期。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案解决的。一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，它包括以下步骤：（1）免疫动物选用SPF鸡作为实验动物，用所述鸡毒支原体疫苗对实验动物进行免疫。（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品。（3）支原体-血清结合、培养取待检样品与鸡毒支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照，将培养板密闭，恒温培养，定期观察。（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色。判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定。判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。优选地，步骤（2）中所述血清采集时间优选免疫程序结束后28～35d，例如28d、30d、32d和34d等。优选地，步骤（2）中所述待检血清做2~10倍系列倍比稀释，优选2～5倍系列稀释。优选地，步骤（3）中所述鸡毒支原体检测用抗原为鸡毒支原体培养物用液体培养基稀释所得，其活菌滴度优选10~10000CCU/ml，更优选100~5000CCU/ml，进一步优选500~1000CCU/ml。优选地，步骤（3）中所述阴性对照孔仅含液体培养基，但不添加鸡毒支原体和待检血清。优选地，步骤（3）中所述阳性对照孔仅含鸡毒支原体检测用抗原，但不添加待检血清。优选地，步骤（4）中所述判定时间为阳性对照孔全部变为黄色时的时间，即阳性孔内培养物pH低于7.0时的时间；此时，肉眼观察阴性对照孔培养液颜色与阳性对照孔颜色有明显差别；猪肺炎支原体检测用抗原活菌滴度与判定时间负相关。优选地，步骤（4）中的所述判定标准的不变色孔是指其中的培养物颜色与阳性对照孔的颜色不同的孔。有益效果：一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，由于采用如上所述的技术方案，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术方法采用血清学检验方法，重复性强，特异性好，精确度高，能直接反映疫苗保护效果。（2）本专利技术方法利用鸡毒支原体生长受血清抑制的特性，在特定的时间判定检测结果，区别不同样品的效价，以样品孔出现颜色变化为判定标准，检测结果更直观可靠，减少主观误差。（3）本专利技术方法与现有的免疫攻毒保护法相比，无需攻毒及剖杀动物，降低对检测环境的要求，避免散毒，而且缩短检测周期，提高检测效率。（4）本专利技术方法可适用于不同菌株鸡毒支原体疫苗效力检验，适用范围广。（5）本专利技术方法通过稀释血清、支原体培养物，仅需简单设备即可实现，技术难度不高，有利于普遍推广。具体实施方案现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。具体公开了该范围的上限和下限具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。实施例1本专利技术方法与免疫攻毒保护法之间的相关性分别应用本专利技术方法和免疫攻毒保护法同时对3批鸡毒支原体灭活疫苗（CR株）进行效力测定，对比两种方法的检测结果。鸡毒支原体灭活疫苗（CR株），瑞普（保定）生物药业有限公司生产，批号分别为161008、161109、161110，市场有售。1.免疫动物选择40～60日龄SPF鸡70羽，随机分为2组，其中免疫组40羽，每羽颈背部皮下或大腿部肌肉注射疫苗0.5ml，对照组30羽不免疫。2.效力测定a本专利技术方法（1）血清采集无菌采集SPF鸡免疫后1、2、3、4、5、6周龄时的全血，分离血清，分装备用。（2）血清稀释取适量待检血清，56℃，30min水浴灭活；用0.01mol/LPBS对血清做2倍系列倍比稀释，得到20～25六个稀释度的血清，作为待检样品。（3）支原体-血清结合、培养取六个稀释度的血清与鸡毒支原体检测用抗原（鸡毒支原体培养物用液体培养基稀释至活菌滴度为1000CCU/ml）各100ul等体积混合，每个样品3个复孔，设阴性对照孔（仅含200ul的液体培养基，但不添加鸡毒支原体和待检血清）和阳性对照孔（仅含200ul鸡毒支原体检测用抗原，但不添加待检血清）。将96孔细胞培养板密闭，置于37℃恒温培养箱中培养。每24h观察一次。（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色。判定时间：培养3日时，阳性对照孔全部变为黄色，即孔内培养物pH低于7.0时，进行结果判定。此时，肉眼观察阴性対照孔培养液颜色与阳性对照孔颜色有明显差别。判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。不变色孔是指其中的培养物颜色与阳性对照孔的颜色不同的孔。b免疫攻毒保护法疫苗免疫后每1周随机抽取8只免疫组鸡，连同对照组鸡6只，在2~3m2的密室（室内温度为15~30℃，相对湿度为50%~70%）内喷雾攻击鸡毒支原体R株培养物500~600ml（每1.0ml含活菌数108.0~109.0颜色变化单位），喷雾时间应不少于5分钟，雾滴在2.0um左右。观察14日，剖检，观察气囊病变，并进行记分。对照组应至少有4只鸡的气囊出现2分以上的病变，免疫鸡的平均气囊保护率应≥60%，计算攻毒保护率。3.结果3批鸡毒支原体灭活疫苗，同时应用本专利技术方法和免疫攻毒保护法进行疫苗效力测定，结果见表1。表1血清抗体水平与免疫攻毒法相关性注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）免疫动物选用SPF鸡作为实验动物，用所述鸡毒支原体疫苗对实验动物进行免疫；（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品；（3）支原体‑血清结合、培养取待检样品与鸡毒支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照，将培养板密闭，恒温培养，定期观察；（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色，判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定，判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。

【技术特征摘要】
1.一种鸡毒支原体疫苗效力测定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）免疫动物选用SPF鸡作为实验动物，用所述鸡毒支原体疫苗对实验动物进行免疫；（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品；（3）支原体-血清结合、培养取待检样品与鸡毒支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照，将培养板密闭，恒温培养，定期观察；（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色，判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定，判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中所述待检血清做2~10倍系列倍比稀释，优选2～5倍系列稀释。3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德宝，郑朝朝，柳珊，郁宏伟，朱秀同，刘涛，高晓磊，张新新，
申请(专利权)人：瑞普保定生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13