一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法技术

本发明专利技术公开了一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，其包括如下步骤：a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；c)对每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；d)根据公式：

【技术实现步骤摘要】
一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法
本专利技术是涉及一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，属于分析化学和药物分析

技术介绍
肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸IdoA；D-葡萄糖醛酸，GlcA)和葡萄糖胺(α-D葡萄糖胺，GlcN)所构成的二糖重复单元组成的具有不同链长的一类线性硫酸化粘多糖，具有良好的抗凝血和抗血栓的特性，用于治疗手术后所引发的静脉血栓栓塞。依诺肝素钠是由猪肠黏膜提取的肝素先经酯化得到肝素钠苄基酯衍生物，再通过碱性条件下β-消除裂解生成的低分子量肝素。由于硫酸化位点和硫酸化程度的差异，加上碱性条件的降解，使依诺肝素钠结构更为复杂。依诺肝素钠重均分子量在3800-5000之间，分子量分布范围要求：小于2000Da不超过20％；2000到8000Da之间的应大于68％；分子量超过8000Da不超过18％。一条具备药理活性的肝素链通常含有三硫酸化二糖区，低硫酸化二糖区和一种独特的抗凝血酶结合五糖结构单元。肝素的抗凝血活性绝大部分是由该五糖序列贡献的。需要指出的是，肝素糖链中含有抗凝血酶结合五糖结构单元的糖链只有20％～50％(通常为三分之一)。含有抗凝血酶结合五糖结构单元的糖链被称为高亲和肝素。还有些糖链可能含有不止一个抗凝血酶结合五糖结构单元，因而表现出更强的抗凝血活性。在依诺肝素钠生产过程中，碱性降解过程包括两个竞争性的化学反应：β-消除和苄基酯水解。降解后得到平均分子量在4500左右的低分子肝素寡糖链(US5389618)。依诺肝素钠寡糖链中依然保留了原来肝素糖链中反映抗凝血活性的五糖结构，在依诺肝素钠中五糖结构单元约占15％～25％。肝素类药物中抗凝血酶结合五糖结构单元较为复杂，其序列通常可以表示为AGA*IA，各个糖残基对肝素与抗凝血酶之间的亲和力是不同的。如图1所示：星号标示的糖是一种少有的3-O-硫酸化GlcN残基，它是肝素与抗凝血酶结合不可或缺的；菱形标记的三个硫酸基团对于肝素与抗凝血酶的高亲和结合也是必不可少的；椭圆形标记的硫酸基团略微重要；半月形标记的GlcA残基也是必需的；与五糖序列非还原端相连的IdoA残基(方形)虽然对抗凝血酶结合不是必需的，但是其始终会出现在肝素的抗凝血酶结合区；图中还显示了一些竞争结合抗凝血酶的天然变异体，例如：N-硫酸化取代第一个氨基糖残基的N-乙酰化和3-O-硫酸化残基的6-O-硫酸化。除此以外，肝素类药物的五糖结构单元含量不同，导致他们具有生物不等效性，这给其应用造成很多不便。综合以上原因使得对肝素类药物的五糖结构单元的定性定量分析任务非常艰巨，到目前为止，肝素类药品都是通过生化测试的方法确定效价，这种实验方法复杂，结果重现性差，而且只能进行相对定量。U.R.Desai等(PharmacyandPharmacologyCommol/Lunications,1(1995)349-353)发展了核磁的方法测定了肝素类药物糖链含有的平均五糖结构单元的个数，能够反映多种药物的抗FXa活性，这种方法不依赖生化测试，更加直接简捷。但是核磁共振仪成本较高，维护和操作复杂，对专业技能要求较高，难于实现大范围普及使用。因此，亟需一种可对肝素类药品中的五糖结构单元直接、简便的定性和定量分析的方法。本申请的专利技术人多年来致力于依诺肝素钠精细结构的定性定量分析研究，并且申请了相关专利，例如：中国专利CN201280000857.2公开了一种基于毛细管电泳的依诺肝素钠精细结构测定方法，该专利采用混合肝素酶将依诺肝素钠完全酶解，接着通过毛细管电泳对依诺肝素钠完全酶解产物中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行分离，然后根据完全酶解后所得到的寡糖的电荷质量比与其电泳淌度之间的线性关系对分离峰所对应的酶解产物，即：构成依诺肝素结构的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行鉴定，以实现对依诺肝素钠精细结构的分析。虽然采用此方法可以对依诺肝素钠中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-环苷结构的寡糖进行鉴定，但是该方法不能实现对其中的五糖结构单元的定性和定量测定，因此还不能真正实现对依诺肝素钠中的精细结构的完全的定性和定量分析，还不能满足依诺肝素钠的质量控制要求。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，以实现对依诺肝素钠中的精细结构的完全的定性和定量分析，以满足依诺肝素钠的质量控制要求。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，包括如下步骤：a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品按亲和活性进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及步骤a)所制备的多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；c)对步骤b)所得到的每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；d)根据公式：计算步骤c)所分离的各个成分的电泳淌度，其中：LT和LD分别是毛细管的总长和有效长度，V为分离电压，t为迁移时间；e)结合寡糖的电荷质量比与电泳淌度之间的如下线性关系：对每一个完全酶解产物的毛细管电泳图中的分离峰所对应的酶解产物进行鉴定，以定性确定出五糖结构单元酶解片段的分离峰；其中：Z/M为寡糖电荷质量比，μ为对应的电泳淌度；f)根据所确定的五糖结构单元酶解片段的分离峰的峰面积，采用面积百分数归一化方法，定量计算出五糖结构单元的含量。作为优选方案，步骤a)中所述的抗凝血酶III的亲和色谱柱的制备，包括如下步骤：①使过量的依诺肝素钠样品与抗凝血酶III进行孵育，以激活抗凝血酶III并占据其活性位点；②使活性位点被保护的抗凝血酶III以共价键固定到色谱柱内的水化填料上。所述抗凝血酶III为野生型或重组型。作为进一步优选方案，进行孵育的缓冲溶液的pH为8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氢钠溶液与450～550mmol/L的氯化钠溶液形成。作为进一步优选方案，依诺肝素钠与抗凝血酶III的质量比为2.5:1～5:1。作为进一步优选方案，所述的水化填料是由NHS或CNBr官能团化的琼脂糖。作为进一步优选方案，1毫升水化填料中含抗凝血酶III的质量≤5毫克。步骤a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱制备不同亲和活性组分的步骤包括：Ⅰ)洗脱抗凝血酶III所结合的依诺肝素钠；Ⅱ)平衡色谱柱；Ⅲ)上样；Ⅳ)进行梯度洗脱和色谱分离。作为优选方案，步骤Ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/L(以2.0～3.0mol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行洗脱。作为优选方案，步骤Ⅱ)采用含有5～30mmol/L(以10～20mmol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液进行平衡10～20分钟。作为优选方案，步骤Ⅲ)先采用含有5～30mmol/L(以10～20mmol/L较佳)氯化钠的Tris-HCl缓冲溶液溶解样品，配制成浓度为10～140mg/mL(以40～100mg/mL较佳)的样品溶液，然后以进样量为1～30μL(以5～20μL较佳)进行上样。作为优选方案，步骤Ⅳ)进行梯度洗脱的条件为：0～15分钟：A相为100％，B相为0；15～20分钟：A相为65％～7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品按亲和活性进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及步骤a)所制备的多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；c)对步骤b)所得到的每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；d)根据公式：

【技术特征摘要】
1.一种可对依诺肝素钠中五糖结构单元进行定性和定量分析的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱对依诺肝素钠样品按亲和活性进行分离并制备成多个不同亲和活性的组分；b)用混合肝素酶对依诺肝素钠样品及步骤a)所制备的多个不同亲和活性的组分分别进行完全酶解；c)对步骤b)所得到的每一个完全酶解产物分别进行毛细管电泳分离分析；d)根据公式：计算步骤c)所分离的各个成分的电泳淌度，其中：LT和LD分别是毛细管的总长和有效长度，V为分离电压，t为迁移时间；e)结合寡糖的电荷质量比与电泳淌度之间的如下线性关系：对每一个完全酶解产物的毛细管电泳图中的分离峰所对应的酶解产物进行鉴定，以定性确定出五糖结构单元酶解片段的分离峰；其中：Z/M为寡糖电荷质量比，μ为对应的电泳淌度；f)根据所确定的五糖结构单元酶解片段的分离峰的峰面积，采用面积百分数归一化方法，定量计算出五糖结构单元的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述的抗凝血酶III的亲和色谱柱的制备包括如下步骤：①使过量的依诺肝素钠样品与抗凝血酶III进行孵育，以激活抗凝血酶III并占据其活性位点；②使活性位点被保护的抗凝血酶III以共价键固定到色谱柱内的水化填料上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：依诺肝素钠与抗凝血酶III的质量比为2.5:1～5:1。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行孵育的缓冲溶液的pH为8.0～8.5、是由150～250mmol/L的碳酸氢钠溶液与450～550mmol/L的氯化钠溶液形成。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：1毫升水化填料中含抗凝血酶III的质量≤5毫克。6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于：所述的水化填料是由NHS或CNBr官能团化的琼脂糖。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)利用抗凝血酶III的亲和色谱柱制备不同亲和活性组分的步骤包括：Ⅰ)洗脱抗凝血酶III所结合的依诺肝素钠；Ⅱ)平衡色谱柱；Ⅲ)上样；Ⅳ)进行梯度洗脱和色谱分离。8.根据权利要求1或2或3或5或7所述的方法，其特征在于：所述抗凝血酶III为野生型或重组型。9.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：康经武，张明瑜，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31