一种核酸分子的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及一种核酸分子的应用。本发明专利技术对白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞，明确miRNAs表达谱变化，获得调控基因HMG1B的miRNAs，以探讨miRNAs在白念珠菌感染时对HMGB1的调控作用，为白念珠菌感染的治疗提供新思路。

Application of a nucleic acid molecule

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the application of a nucleic acid molecule. The invention of Candida albicans infection in primary mouse peritoneal macrophages, clear miRNAs expression of HMG1B gene, obtained miRNAs, miRNAs to explore the regulation of HMGB1 in Candida albicans infection, to provide new ideas for the treatment of Candida albicans infection.

【技术实现步骤摘要】
一种核酸分子的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种核酸分子的应用。
技术介绍
深部真菌感染(deepfungalinfection，DFI)是一种严重的感染性疾病，它是指致病性真菌侵犯皮下组织、黏膜和内脏，感染器官所引起的真菌性感染疾病。其中，白念珠菌是人类深部真菌感染最常见的病原菌之一。近年来，由于广谱抗生素的长期滥用、内置医疗器械和器官移植等侵入性操作不断增加，使白念珠菌感染的发病率和死亡率持续上升，尽管研发了许多抗真菌药物，但由于严重的毒副作用，以及真菌耐药株不断增加，使DFI的治疗成为临床面临的棘手难题。高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox1，HMGB1)是一种含量丰富的非组蛋白结合蛋白，分子量约30kd。在1999年，Wang等发现HMGB1可通过活化巨噬细胞，从胞内主动分泌释放到胞外，不断介导炎症反应，是脓毒症晚期炎症反应的中心环节。课题组前期的临床及动物实验均发现HMGB1在白念珠菌性脓毒症中也发挥着重要作用，但其生物学机制尚不明确。microRNA(miRNAs)是一种高度保守的长链非编码小核糖核酸，在转录后水平沉默或抑制靶基因的表达。目前已证实大量的miRNAs作为一种新型的炎性反应调控分子，对脓毒症中多种炎症因子的表达及释放具有重要的调控。作用为脓毒症晚期重要的炎性细胞因子HMGB1，其表达及释放必然会受到相关miRNAs调控。目前，大量miRNAs对HMGB1调控作用的研究集中在细菌性脓毒症方面，而在白念珠菌性脓毒症中，尚缺乏研究。因此，研究白念珠菌性脓毒症中调控HMGB1的miRNAs具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种核酸分子的应用。本专利技术对白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞，分析miRNAs的表达谱变化，获得调控HMGB1的miRNAs，以探讨miRNAs在白念珠菌感染时对HMGB1的调控作用，为白念珠菌感染的治疗提供新思路。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术将白念珠菌刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞后，用miRNA基因芯片筛选出222个差异表达的miRNAs，在21个差异表达显著的miRNAs中(FC≥1.5，p＜0.05)，最终选择mmu-miR-146b-5p进行后续实验：有6个miRNAs生物信息学软件(miRWalk、Microt4、miRMap、miRNAMap、PITA和RNA22)预测到HMGB1是mmu-miR-146b-5p的直接作用靶点之一。生物信息学网站miRbase发现mmu-miR-146b-5p(UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU)和hsa-miR-146b-5p序列完全一致，具有临床研究的价值。另外，在白念珠菌感染小鼠原代腹腔巨噬细胞后，miRNAs基因芯片和qRT-PCR均显示mmu-miR-146b-5p变化显著，均有统计学意义。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子选自RNA、DNA或核酸类似物分子，所述核酸分子具有：(Ⅰ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子选自RNA、DNA或核酸类似物分子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。双萤光素酶报告基因检测系统是在同一细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而反应中没有交叉干扰。并且由于有超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于miRNAs靶基因验证，可以精确灵敏地检测出miRNAs是否直接作用于靶基因。由于miRNAs与靶基因的3'-UTR区特异性结合，与靶基因完全互补或不完全互补，形成沉默复合体或抑制靶基因的转录，对靶基因的表达起重要的负调控作用，最终导致与靶基因相关联的萤火虫荧光素酶活性降低。本专利技术用生物信息学软件预测出mmu-miR-146b-5p与靶基因HMGB13'-UTR区特异的结合位点，构建含双荧光素酶的wt-HMGB13'-UTR区表达载体；并将HMGB13'-UTR区的结合位点进行点突变，构建mut-HMGB13'-UTR区突变载体作为阴性对照。将空载体、wt-HMGB13'-UTR表达载体和mut-HMGB13'-UTR区突变载体分别与mmu-miR-146b-5p模拟物(mimic)和mimicNC共培养于293T细胞，结果显示mmu-miR-146b-5p与wt-HMGB13'-UTR区表达载体共培养组，萤火虫荧光素酶活性较对照组明显降低，表明mmu-miR-146b-5p能与HMGB13'-UTR区特异性结合，并抑制HMGB1的表达，提示HMGB1是mmu-miR-146b-5p的直接作用靶点。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子选自RNA、DNA或核酸类似物分子，所述核酸分子具有：(Ⅰ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子选自RNA、DNA或核酸类似物分子。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有90％同源性的序列。HMGB1是一种含量丰富的非组蛋白核蛋白，分子量约30kD，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率快而得名。其普遍存在于哺乳动物体内，参与DNA的复制、转录、修饰，修复受损伤的DNA以及调节基因的转录活性等作用。近年研究发现，HMGB1作为一种晚期炎性细胞因子，在脓毒症、脓毒性休克和多器官损伤中发挥重要作用。在细菌性脓毒症中，内毒素和TNF-α、IL-1β和IL-6等多种促炎因子激活单核/巨噬细胞、NK细胞和树突状细胞后，HMGB1由细胞核分泌主动到细胞外。同时，炎症反应促使多种细胞凋亡和坏死，使细胞胞膜完整性被破坏，导致胞核内HMGB1被动释放至胞外，加重炎性反应。由主动和被动方式释放到细胞外的HMGB1，可进一步诱导活化的单核/巨噬细胞产生多种炎症介质，激活下游的炎性细胞因子进一步释本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子在负调控HMGB1表达中的应用，其特征在于，所述核酸分子具有：(Ⅰ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的互补序列；或(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子在负调控HMGB1表达中的应用，其特征在于，所述核酸分子具有：(Ⅰ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。2.一种核酸分子在负调控HMGB1由胞核到胞浆转位的应用，其特征在于，所述核酸分子具有：(Ⅰ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或(Ⅱ)如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的互补序列；或(Ⅲ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的序列；或(Ⅳ)与(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)所述序列至少有80％同源性的序列。3.一种核酸分子在制备白念珠菌感染的治疗药物中的应用，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙航，吴传新，程静，王云英，王姣焦，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆,50