真菌基因组修饰系统及使用方法技术方案

提供了用于在真菌细胞的基因组中的靶位点处进行基因组修饰的组合物和方法。这些方法和组合物的方面涉及指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统，用于促进在真菌宿主细胞基因组中的期望靶位点处插入供体DNA。

Fungal genome modification systems and methods of use

Compositions and methods for genome modification at target sites in fungal cell genomes are provided. The aspects of these methods and compositions relate to the guidance of the polynucleotide /Cas endonuclease system to facilitate the insertion of donor DNA into the desired target site in the fungal host cell genome.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求均于2014年12月16日提交的PCT专利申请序列号PCT/CN2014/093916、PCT/CN2014/093914和PCT/CN2014/093918的优先权，这些专利通过引用以其全文特此结合。序列表将按照37C.F.R.§1.52(e)、经由EFS提交的序列表通过引用结合在此。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2015年12月11日创建的文件“40532-WO-PCT-5(2015-831)_ST25.txt”，其大小为146千字节。专利技术背景细菌和古细菌已经进化了适应性免疫防御，被称为成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统，该Cas系统能以序列特异性方式在DNA中引入双链断裂。Cas系统通过包括短RNA序列(tracrRNA和crRNA)和RNA依赖性内切核酸酶(Cas内切核酸酶)的核糖核蛋白复合物的活性执行它们的功能，该RNA依赖性内切核酸酶靶向特定DNA序列(通过与crRNA的一部分的同源性，被称为可变靶向结构域)并且在靶标中产生双链断裂。CRISPR基因座首先在大肠杆菌(E.coli)中被识别(Ishino等人(1987)J.Bacterial.[细菌学杂志]169:5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.[细菌学杂志]171:3553-3556)，其中相似的散置的短序列重复随后在许多细菌物种中被鉴定出，这些细菌物种包括但不限于地中海富盐菌(Haloferaxmediterranei)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、鱼腥藻(Anabaena)和结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.[分子微生物学]10:1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.[新发传染病]5:254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]1307:26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.[分子微生物学]17:85-93)。众所周知，在基因组DNA中的特定靶位点处诱导剪切可以用于在该位点处或附近引入修饰。例如，当靶向的DNA位点含有双链断裂时，已显示用于基因靶向的同源重组被增强(参见，例如Rudin等人，Genetics[遗传学]122:519-534；Smih等人，Nucl.AcidsRes.[核酸研究]23:5012-5019)。鉴于Cas系统的位点特异性性质，已经描述了基于这些系统的基因组修饰/工程化技术，包括在哺乳动物细胞中的那些(参见，例如Hsu等人；Cell[细胞]第157卷，p1262-1278，2014年6月5日，标题为“用于基因组工程的CRISPR-Cas9的开发与应用(DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering)”)。基于Cas的基因组工程的功能来自于通过设计重组crRNA(或等效功能的多核苷酸)(其中crRNA的DNA靶向区域(可变靶向结构域)与基因组内所希望的靶位点同源)并且将其与Cas内切核酸酶(通过任何方便的方法)组合成宿主细胞中的功能性复合物来靶向复杂基因组内几乎任何特定位置的能力。虽然已经将基于Cas的基因组工程技术应用于许多不同的宿主细胞类型，但是在真菌细胞中有效利用这样的系统已被证明是困难的。因此，仍然需要开发有效率且有效的基于Cas的基因组工程方法和用于修饰/改变真菌细胞中的基因组靶位点的组合物。简要概述提供了组合物和方法，这些组合物和方法涉及使用指导RNA/Cas内切核酸酶系统用于在真菌细胞(例如丝状真菌细胞)的基因组中的靶位点处插入供体DNA。本披露的方面涉及在真菌细胞的基因组中的靶位点处插入供体DNA的方法。在一些实施例中，该方法包括：a)向真菌细胞群体中引入Cas内切核酸酶、指导RNA和供体DNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成一种复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够在真菌细胞的基因组的基因组座位中的靶位点处引入双链断裂；并且b)从该群体中鉴定在基因组座位中的靶位点处已经发生了供体DNA的插入的至少一个真菌细胞，其中该Cas内切核酸酶、指导RNA或两者都被瞬时引入了真菌细胞群体中。在某些实施例中，其中该插入不是经由该供体DNA与所述真菌细胞的基因组之间的同源重组发生的。在某些实施例中，供体DNA不包含与基因组座位中的基因组序列同源的序列。在一些实施例中，供体DNA不包含与至少150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸长度的基因组序列同源的序列。在一些实施例中，供体DNA不包含与至少200个核苷酸长度上的基因组序列同源的序列。在某些实施例中，供体DNA的插入会中断基因组座位的表达或功能。在某些其他实施例中，插入不会中断基因组座位的表达或功能。在该方法的一些实施例中，供体DNA包含目的基因。在某些实施例中，供体DNA包含编码目的基因产物的表达盒。在一些实施例中，目的基因或表达盒编码目的蛋白质。在某些实施例中，目的蛋白质是酶。在具体实施例中，目的蛋白质是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的杂合物或混合物。在又其他具体实施例中，目的蛋白质是肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的杂合物或混合物。在某些实施例中，目的基因或表达盒编码表型标记，例如可检测的标记、可选择标记、显性异源可选择标记、报告基因、营养缺陷型标记、抗生素抗性标记等(参见下面说明书)。可以使用任何方便的表型标记。在该方法的一些实施例中，供体DNA包含或进一步包含(例如，在供体DNA包含目的基因或表达盒的实施例中)与基因组座位中的基因组序列同源的序列(有时在本文中被称为“重复序列”)，但是该重复序列不用于将供体DNA插入基因组座位的靶位点处。在一些实施例中，该重复序列为至少约150、200、300、400或500个核苷酸长。在某些实施例中，该基因组序列(即，与供体DNA中的重复序列同源的序列)和该靶位点位于基因组缺失靶标区域的侧翼。该基因组缺失靶标区域是由用户定义的一个区域。在某些实施例中，供体DNA的插入导致该基因组序列和与该基因组序列同源的序列(包括在供体DNA中)位于包含该基因组缺失靶标区域的环出靶标区域的侧翼。该基因组序列和与该基因组序列同源的序列在本文中有时都被称为“重复序列”。在供体DNA包含编码表型标记的表达盒的一些实施例中，该基因组序列和与该基因组序列同源的序列位于包括该基因组缺失靶标区域和该表型标记(例如可选择标记)的环出靶标区域的侧翼。(参见图1，该图1是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在真菌细胞的基因组中的靶位点处插入供体DNA的方法，该方法包括：a)向真菌细胞的群体中引入Cas内切核酸酶、指导RNA和供体DNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成复合物，该复合物使该Cas内切核酸酶能够在所述真菌细胞的基因组的基因组座位中的靶位点处引入双链断裂；并且b)从该群体中鉴定在该基因组座位中的该靶位点处已经发生了该供体DNA的插入的至少一个真菌细胞，其中该Cas内切核酸酶、该指导RNA或两者都被瞬时地引入该真菌细胞的群体中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.16 CN PCT/CN2014/093914;2014.12.16 CN PCT/1.一种用于在真菌细胞的基因组中的靶位点处插入供体DNA的方法，该方法包括：a)向真菌细胞的群体中引入Cas内切核酸酶、指导RNA和供体DNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成复合物，该复合物使该Cas内切核酸酶能够在所述真菌细胞的基因组的基因组座位中的靶位点处引入双链断裂；并且b)从该群体中鉴定在该基因组座位中的该靶位点处已经发生了该供体DNA的插入的至少一个真菌细胞，其中该Cas内切核酸酶、该指导RNA或两者都被瞬时地引入该真菌细胞的群体中。2.如权利要求1所述的方法，其中该插入不是经由该供体DNA与所述真菌细胞的基因组之间的同源重组发生的。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该供体DNA不包含与该基因组座位中的基因组序列同源的序列。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该供体DNA的插入中断该基因组座位的表达或功能。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该供体DNA包含目的基因。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该供体DNA包含编码目的基因产物的表达盒。7.如权利要求6所述的方法，其中该目的基因产物是目的蛋白质。8.如权利要求6所述的方法，其中该目的基因产物是表型标记。9.如权利要求8所述的方法，其中该表型标记选自下组，该组由以下各项组成：营养缺陷型标记、抗生素抗性标记、显性异源可选择标记和报告基因。10.如权利要求1、2和4-9中任一项所述的方法，其中该供体DNA包含与在该基因组座位中的基因组序列同源的序列，其中该基因组序列和该靶位点位于基因组缺失靶标区域侧翼，并且其中该供体DNA的插入导致该基因组序列以及与该基因组序列同源的序列位于包含该基因组缺失靶标区域的环出靶标区域的侧翼。11.如权利要求10所述的方法，该方法进一步包括：c)在允许该环出靶标区域环出的条件下培养该至少一个经鉴定的真菌细胞，并且d)在培养物中鉴定该环出靶标区域已经发生了环出的至少一个真菌细胞。12.一种用于在真菌细胞的基因组中使靶标区域缺失的方法，该方法包括：a)向真菌细胞的群体中引入Cas内切核酸酶、指导RNA和供体DNA，其中该Cas内切核酸酶和指导RNA能够形成使得该Cas内切核酸酶能够在所述真菌细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂的复合物，并且允许该供体DNA被插入在该靶位点处，其中该供体DNA包含与所述真菌细胞的基因组序列同源的序列，并且其中该基因组序列和该靶位点位于该真菌细胞基因组中的靶标区域的侧翼；b)在允许该基因组序列以及与该基因组序列同源的序列之间进行同源重组的条件下培养该真菌细胞的群体；并且c)在培养物中鉴定已经发生了该靶标区域的缺失的至少一个真菌细胞；其中该Cas内切核酸酶、该指导RNA或两者都被瞬时地引入该真菌细胞的群体中。13.如权利要求12所述的方法，该方法进一步包括：在步骤a)和b)之间从该群体中鉴定在该靶位点处已经发生了该供体DNA的插入的至少一个真菌细胞的步骤。14.如权利要求12或13所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛晶，X·顾，S·M·马德里，D·宋，M·宋，M·沃德，
申请(专利权)人：丹尼斯科美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US