一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法技术

本发明专利技术公开了一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，属于生物技术领域，本发明专利技术方法包括以下步骤：（1）免疫动物；（2）血清采集、稀释；（3）支原体‑血清结合、培养；（4）结果判定。本发明专利技术使用血清学方法替代动物试验，操作简单，技术要求低，重复性强，特异性好，该方法的建立避免了免疫攻毒保护法结果判定的主观性，避免散毒，同时也为制定、优化仔猪免疫程序提供了依据，适用于普遍推广。

Efficacy test method of Mycoplasma pneumoniae vaccine for swine

The invention discloses a method for the determination of Mycoplasma hyopneumoniae vaccine, belongs to the field of biotechnology, the method of the invention comprises the following steps: (1) immune animal; (2) serum collection and dilution; (3), combined with serum mycoplasma culture; (4) the results of judgment. The present invention using serological methods alternatives to animal testing, simple operation, low technical requirements, strong repeatability, good specificity, this method avoids the subjectivity of the immune toxicity protection law result, to avoid spreading poison, but also for the formulation, provide a basis for optimization of immune procedure of piglets, suitable for universal promotion.

【技术实现步骤摘要】
一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法
本专利技术涉及一种疫苗效力的测定方法，尤其是一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，属于生物

技术介绍
猪支原体肺炎(Swineenzootichyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mh)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病，主要临床表现为咳嗽、气喘，猪只感染后往往会生长发育迟缓，饲料转化率严重降低，导致重大的经济损失。且猪只一旦感染支原体极易继发其他病毒和细菌感染，从而导致死亡率升高。国内外资料及大量临床数据表明，疫苗免疫是预防本病最重要的手段。国内外猪肺炎支原体疫苗免疫效果评价标准不一，常用的方法有：仔猪免疫攻毒法、家兔IHA测定法、ELISA抗体检测法。仔猪免疫攻毒法的弊端是攻毒需要有负压的环境，攻毒技术难以掌握，并且每次需要剖杀试验猪计算肺部病变减少率，受主观影响大，检测周期长，成本高，重复性差；家兔IHA测定法以家兔做为实验动物，为非靶动物，不能准确反应疫苗真实效力；ELISA抗体检测法测定疫苗的相对效力，而ELISA检测法受试剂盒批间差异的影响，重复性差，且多处文献报道ELISA抗体水平与疫苗保护水平不相关。因此，亟需建立一种操作简单，重复性强，特异性强且易于普遍推广的检验方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有效力测定方法之缺陷，提供一种新型的猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，以提高检测精确度，缩短检测周期。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案解决的。一种猪肺炎支原体疫苗效力检测方法，它包括以下步骤：（1）免疫动物筛选猪肺炎支原体抗原抗体阴性动物作为实验动物，用所述猪肺炎支原体疫苗对实验动物进行免疫。（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，用PBS对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品。（3）支原体-血清结合、培养取待检样品与猪肺炎支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照。将培养板密闭，恒温培养，定期观察。（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色。判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定。判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。优选地，步骤（1）中所述实验动物为仔猪、家兔、种公猪或空怀母猪。优选地，步骤（2）中所述血清采集时间优选免疫程序结束后28～35d，例如28d、30d、32d和34d等。优选地，步骤（2）中所述待检血清做2~10倍系列倍比稀释，优选2～5倍系列稀释。优选地，步骤（3）中所述猪肺炎支原体检测用抗原为猪肺炎支原体培养物用液体培养基稀释所得，其活菌滴度优选10~10000CCU/ml，更优选100~5000CCU/ml，进一步优选500~1000CCU/ml。优选地，步骤（3）中所述阴性对照孔仅含液体培养基，但不添加猪肺炎支原体和待检血清。优选地，步骤（3）中所述阳性对照孔仅含猪肺炎支原体检测用抗原，但不添加待检血清。优选地，步骤（4）中所述判定时间为阳性对照孔全部变为黄色时的时间，即阳性孔内培养物pH低于7.0时的时间；此时，肉眼观察阴性对照孔培养液颜色与阳性对照孔颜色有明显差别；猪肺炎支原体检测用抗原活菌滴度与判定时间负相关。优选地，步骤（4）中的所述判定标准的不变色孔是指其中的培养物颜色与阳性对照孔的颜色不同的孔。有益效果：一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，由于采用如上所述的技术方案，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术方法采用血清学检验方法，重复性强，特异性好，精确度高，能直接反应疫苗免疫保护效果，同时可为制定、优化仔猪免疫程序提供了依据。（2）本专利技术方法利用猪肺炎支原体生长受血清抑制的特性，在特定的时间判定检测结果，区别不同样品的效价，以样品孔出现颜色变化为判定标准，检测结果更直观可靠，减少主观误差。（3）本专利技术方法与传统的仔猪免疫攻毒法相比，无需攻毒及剖杀动物，降低对检测环境的要求，避免散毒，而且缩短检测周期，提高检测效率。（4）本专利技术方法可适用于不同菌株猪肺炎支原体疫苗效力测定，适用范围广。（5）本专利技术方法通过稀释血清、支原体培养物，仅需简单设备即可实现，技术难度不高，有利于普遍推广。具体实施方案现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。具体公开了该范围的上限和下限具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。实施例1猪肺炎支原体疫苗效力检测对比试验分别应用本专利技术方法、ELISA抗体检测法和仔猪免疫攻毒法同时检测同一批猪肺炎支原体灭活疫苗（J株），对比三种方法检测结果。猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）：瑞普（保定）生物药业有限公司生产，10头份/瓶，市场有售。1.免疫动物选择7~14日龄猪肺炎支原体抗原抗体阴性的健康仔猪6组，5头/组，各颈部肌肉注射猪肺炎支原体灭活疫苗（J株）2ml，首免后2周以相同剂量和方式进行2免。设置不免疫组对照6组，5头/组。2.效力测定a.本专利技术方法（1）血清采集无菌采集实验动物免前和2次免疫后1、2、3、4、5、6周时的全血，分离血清，分装备用。（2）血清稀释取适量待检血清，56℃，30min水浴灭活；用0.01MPBS对血清做2倍系列倍比稀释，得到20～26七个稀释度的血清，作为待检样品。（3）支原体-血清结合、培养取待检样品与猪肺炎支原体检测用抗原（猪肺炎支原体培养物用A26液体培养基稀释至活菌滴度为1000CCU/ml）各100ul等体积混合，每个样品3个复孔，同时设阴性对照孔（仅含200ul的液体培养基，但不添加猪肺炎支原体和待检血清）和阳性对照孔（仅含200ul猪肺炎支原体检测用抗原，但不添加待检血清）。将96孔细胞培养板密闭，置于37℃恒温培养箱中培养。每24h观察一次。（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色。判定时间：培养6日时，阳性对照孔全部变为黄色，即孔内培养物pH低于7.0时，进行结果判定。此时，肉眼观察阴性对照孔培养液颜色与阳性对照孔颜色有明显差别。判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。不变色孔是指其中的培养物颜色与阳性对照孔的颜色不同的孔。b.ELISA抗体测定方法（1）血清采集制备方法同a方法步骤（1）（2）ELISA检测按照猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒说明书操作。c.仔猪免疫攻毒法实验动物2次免疫后每1周随机抽取一组免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫动物筛选猪肺炎支原体抗原抗体阴性动物作为实验动物，用所述猪肺炎支原体疫苗对实验动物进行免疫；（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品；（3）支原体‑血清结合、培养取待检样品与猪肺炎支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照，将培养板密闭，恒温培养，定期观察；（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色，判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定，判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。

【技术特征摘要】
1.一种猪肺炎支原体疫苗效力测定方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫动物筛选猪肺炎支原体抗原抗体阴性动物作为实验动物，用所述猪肺炎支原体疫苗对实验动物进行免疫；（2）血清采集、稀释免疫程序结束后，无菌采集动物血清，灭活，对血清做倍比稀释，得到不同稀释度的血清，作为待检样品；（3）支原体-血清结合、培养取待检样品与猪肺炎支原体检测用抗原等体积混合，每个样品设置复孔，同时设阴、阳性对照，将培养板密闭，恒温培养，定期观察；（4）结果判定试验成立条件：阳性对照孔均变为黄色，阴性对照孔均不变色，判定时间：当阳性对照孔全部变为黄色时进行结果判定，判定标准：将不变色孔的待检样品最高稀释倍数判定为所述待检样品的效价。2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中所述实验动物为仔猪、家兔、种公猪或空怀母猪。3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中所述待检血清做2~10倍系列倍比稀释，优选2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑朝朝，张德宝，高晓磊，刘涛，郁宏伟，朱秀同，柳珊，杨保收，
申请(专利权)人：瑞普保定生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13