用于检测RhD mRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法技术

技术编号:16396115 阅读:66 留言:0更新日期:2017-10-17 17:50
本发明专利技术公开了一种用于检测RhD mRNA剪接体实时荧光定量PCR引物组合、试剂盒及检测方法,属于生物检测技术领域。本发明专利技术针对RhD mRNA剪接体序列设计实时荧光定量PCR引物组合,该引物的特异性强,不受其他非目的基因干扰,能快速、高效、准确地对RhD mRNA剪接体进行定量。本发明专利技术应用实时荧光定量PCR方法对RhD mRNA剪接体进行定量检测,方法简单、精确,无管道内污染,无需凝胶电泳,此方法可以准确定量不同个体RhD mRNA剪接体的拷贝数。结果重现性好,检测灵敏度高,特异性强,可用于高通量的样品检测。

PCR primer combinations, kits and real-time fluorescent quantitative detection methods for detecting RhD mRNA splicing bodies

The invention discloses a method for the detection of RhD mRNA spliceosome real-time fluorescence quantitative PCR primers, kit and detection method, which belongs to the technical field of biological detection. The invention is based on RhD mRNA splicing sequence design of real time fluorescent quantitative PCR primer combinations, the primer specificity is not affected by other non target gene interference, rapid, efficient and accurate quantitation of RhD mRNA splicing. The application of real-time fluorescent quantitative PCR method for quantitative detection of RhD mRNA splicing, method is simple and accurate, no pollution in the pipeline, without gel electrophoresis, this method can accurately and quantitatively different copy number of individual RhD mRNA splicing. The results show good reproducibility, high sensitivity and strong specificity, and can be used for high-throughput sample detection.

【技术实现步骤摘要】
用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法
本专利技术涉及一种用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合,同时还涉及包含该引物组合的试剂盒及RhDmRNA剪接体实时荧光定量检测方法,属于生物检测

技术介绍
RH基因的复杂性直接体现在RhD抗原表达的多态性,这被认为是不仅与RhDmRNA水平上的异质性有关还与相关基因外显子的缺失、数量表达等相关。同时LeVanKim等还发现:RHCE基因存在选择性剪接而形成不同形式的基因转录产物[1],同样的有研究者发现在正常的D抗原阳性的个体中存在第7外显子至第9外显子的多种复杂的选择性剪接[2],该剪接体的多态性决定RHD基因表达D抗原的特性。血型基因的遗传背景有明显的种族间差异,是因为不同人种的RhDmRNA基因出现选择性多样剪接出现RhD亚型所造成[3]。mRNA即messengerRNA信使RNA是由DNA经由转录而来,带着相应的遗传讯息,为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。基于RHD基因的多态性,本文建立实时荧光定量的方法对不同个体的RhDmRNA剪接体检测,通过监测RhDmRNA表达的多态性了解不同个体RHD基因的差异。实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)/QRT-PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光标记物,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程,通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。[1]LEVANKC,MOUROI,CHERIF-ZAHARB,etal.MolecularcloningandprimarystructureofthehumanbloodgroupRhDpolypeptideProeNatl.AcadSeiUSA,1992,89(22):10925-10929.[2]邵超鹏,熊文,等.替代剪切形成多种形式的RhDmRNA.中国输血杂志,2004,17(5):310-314.[3]LEVANKC,CHERIF-ZAHARB,RAYNALV,etal.MultipleRhmessengerRNAisoformsareproducedbyalternativesplicing.Blood,1992,80(4):1074-1078.
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足,本专利技术的目的在于提供一种检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量PCR检测方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合,包括以下三对引物的至少一对:(1)用于扩增全长RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-CCCACAGCTCCATCATGGG-3'(SEQIDNO:1),下游引物:5'-GCCAATCATGCCATTGCCGGC-3'(SEQIDNO:2);(2)用于扩增缺失exon-7的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-TGGCTGGGCTGATCTCCG-3'(SEQIDNO:3)下游引物:5'-TGGAAGCCAATCCGGCAGGT-3'(SEQIDNO:4);(3)用于扩增缺失exon-7,8,9的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-TGGCTGGGCTGATCTCCG-3'(SEQIDNO:5)下游引物:5'-CAAATGAGGAAACGGCAGGT-3'(SEQIDNO:6)。优选地,优选地,所述引物组合物中各引物的浓度为5pmol/L。一种检测RhDmRNA剪接体的试剂盒,包括所述的PCR引物组合物。优选地,所述的用于检测RhDmRNA剪接体的试剂盒还包括PCR级H2O,MasterMix。一种用于检测RhDmRNA剪接体的实时荧光定量PCR检测方法,包括如下步骤:(3)配制若干个不同浓度标准品;(4)配制PCR反应液,包括上述PCR引物组合物;(3)PCR扩增:将上述PCR反应液与不同浓度的标准品或待测样品分别混合进行PCR扩增;(4)利用不同浓度的标准品得到的数据制作标准曲线;(5)利用标准曲线计算待测样品的浓度。优选地,所述步骤(1)中,所述标准品为选自以下至少一种所示的核苷酸序列:全长标准品:5'-CCCACAGCTCCATCATGGGCTACAACTTCAGCTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAGATCATCTACATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGGAGCCGGCAATGGCATGATTGGC-3'(SEQIDNO:7)缺失exon-7标准品:5'-TGGCTGGGCTGATCTCCGTCGGGGGAGCCAAGTACCTGCCGGATTGGCTTCCA-3'(SEQIDNO:8)缺失exon-7,8,9标准品:5'-TGGCTGGGCTGATCTCCGTCGGGGGAGCCAAGTACCTGCCGTTTCCTCATTTG-3'(SEQIDNO:9)。优选地,所述步骤(1)中,所述若干为选自6、8、10、12、16中的一种。优选地,所述步骤(1),所述不同浓度的标准品相邻浓度之间的梯度为1个数量级,即浓度相差10倍。优选的,所述步骤(2)中,所述PCR反应液中还包括PCR级H2O,MasterMix。优选的,所述步骤(3)中,PCR扩增的反应程序为:95℃预变性10min;96℃变性10s,60℃复性3s,72℃延伸3秒,循环35次,72℃再延伸10s。优选地,所述步骤(5)中,所述计算是利用2ndDerivativeMax计算法进行的。本专利技术的主要优点包括:本专利技术针对RhDmRNA剪接体序列设计实时荧光定量PCR引物组合,该引物的特异性强,不受其他非目的基因干扰,能快速、高效、准确地对RhDmRNA剪接体进行定量。本专利技术应用实时荧光定量PCR方法对RhDmRNA剪接体进行定量检测,方法简单、精确,无管道内污染,无需凝胶电泳,此方法可以准确定量不同个体RhDmRNA剪接体的拷贝数。结果重现性好,检测灵敏度高,特异性强,可用于高通量的样品检测。附图说明图1显示了全血提取高质量、高纯度的mRNA电泳图。图2RhDmRNA剪接体实时荧光定量实时监控。具体实施方式下述实施例及试验例仅对本专利技术作进一步详细说明,但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合物的制备方法,引物组合物包含下面3对引物中的至少一对:用于扩增全长RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-CCCACAGCTCCATCATGGG-3'(SEQIDNO:1),下游引物:5'-GCCAATCATGCCATTGCCGGC-3'(SEQIDNO:2);用于扩增缺失exon-7的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-TGGCTGGGCTGATCTCCG-3'(SEQIDNO:3)下游引物:5'-TGGAAGCCAATCCGGCAGGT-3'(SEQIDNO:4);以及用于扩增缺失exon-7,8,9的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别为:上游引物:5'-TGGCTGGGC本文档来自技高网
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<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/27/201710674747.html" title="用于检测RhD mRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法原文来自X技术">用于检测RhD mRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法</a>

【技术保护点】
一种用于检测RhD mRNA剪接体的PCR 引物组合物,其特征在于,包括以下三对引物的至少一对:(1)用于扩增全长RhD mRNA剪接体的1 对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:1所示,(2)用于扩增缺失exon‑7的RhD mRNA剪接体的1 对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;;(3)用于扩增缺失exon‑7,8,9的RhD mRNA剪接体的1 对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合物,其特征在于,包括以下三对引物的至少一对:(1)用于扩增全长RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:1所示,(2)用于扩增缺失exon-7的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示;;(3)用于扩增缺失exon-7,8,9的RhDmRNA剪接体的1对共2条引物,2条引物的序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。2.根据权利要求1所述的用于检测RhDmRNA剪接体的PCR引物组合物,其特征在于,所述引物浓度分别为5pmol/L。3.一种用于检测RhDmRNA剪接体的试剂盒,其特征在于,包括所述的PCR引物组合物。4.根据权利要求3所述的用于检测RhDmRNA剪接体的试剂盒,其特征在于,还包括PCR级H2O,MasterMix。5.一种用于检测RhDmRNA剪接体的实时荧光定量PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤:配制若干个不同浓度标准品;配制PCR反应液,包括上述PCR引物组合物;(3)PCR扩增:将上述PCR反应液与不同浓度的标准品或待测样品分别混合进行PCR扩增;(4)利用不同...

【专利技术属性】
技术研发人员:梁延连唐雄驰张印则吴凡徐庆萍
申请(专利权)人:深圳市血液中心
类型:发明
国别省市:广东,44

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