一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用，具体的本发明专利技术公开了一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，首先将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；获得的重组质粒，酶切后连接到带Nisin抗性基因nis

Construction and application of a food grade lactic acid expression system expressing antifreeze peptide

The invention discloses a food grade lactic acid bacteria expression of antifreeze peptide expression construct and application specific system, the invention discloses a method for preparing food grade lactic acid bacteria can express antifreeze peptide expression system, first will build. Long vector antifreeze peptide gene encoding synthetic; recombinant plasmid obtained. After digestion with Nisin connected to the resistance gene NIS

【技术实现步骤摘要】
一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用
本专利技术属于生物与食品
，具体地本专利技术设计一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌的制备方法及其抗冻活性的表征，更具体地本专利技术涉及一种新型冷冻干燥保护剂抗冻肽在乳酸菌食品级表达系统上的构建和应用。
技术介绍
抗冻肽(antifreezepeptide，AFP)是一些低温生物为适应极端寒冷环境而产生的一类多肽或糖肽。AFP具有特殊的抗冻活性，主要表现为：(1)能结合到冰晶表面并抑制冰晶进一步生长；(2)能以非依数形式降低溶液的冰点，使溶液的熔点和冰点之间出现差值，表现为热滞活性；(3)具有冰重结晶抑制效应。由于AFP特殊的抗冻作用可使零下低温环境下存活的生物避免受到细胞间形成冰晶引起的损伤或致死作用，因此近年来AFP的资源开发及其应用引起了广泛关注，并发现在冷冻食品加工与储藏、细胞保藏、抗冻农作物栽培、渔业养殖、器官移植和冷冻手术等领域开发中具有诱人的商业应用前景。由于AFP具有重要的商业应用价值，因此近年来国际上对AFP研究引起日益广泛的关注。至今人们已经从鱼类、昆虫、植物、细菌、真菌中发现了数十种抗冻蛋白，并对其结构、功能和抗冻特性进行了全面和深入研究。但是，从天然低温生物中提取AFP的成本高得率低，影响了其应用价值。如何提高AFP产量降低其生产成本是实现AFP应用于冷冻食品加工需要解决的一个瓶颈问题。目前已经有相关研究在AFP结构和功能研究基础上，探索通过应用现代生物技术，采用化学合成和基因工程生物表达的方法进行AFP制备。但是化学合成和基因工程生物表达的AFP的某些安全性问题也不容质疑。化学合成产物中有毒有害痕量物质残留影响其安全性。利用基因工程菌，尤其是大肠杆菌是目前广泛采用的进行活性蛋白或多肽生物表达的宿主。但由于大肠杆菌是一种致病菌，而且其使用的抗生素标记会在人体肠道中发生生物移植，影响人体正常的免疫功能，因此作为大肠杆菌表达分泌的蛋白或多肽产物在食品工业中的应用由于安全性问题受到了限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法及其具体应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：首先构建一种具有细胞低温保护活性的抗冻肽，然后采用分子调控手段，利用带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌食品级胞内表达载体pNZ8149构建表达该抗冻肽的重组质粒，通过电转化乳酸乳球菌NZ3900，表达抗冻肽，构建食品级基因工程菌，最后表征抗冻肽表达对乳酸乳球菌抗冻干胁迫性的影响。本专利技术的第一方面，提供了一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，所述方法包括步骤：1)将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；2)克隆并提取步骤1)获得的重组质粒，酶切后获得所述抗冻肽DNA序列；3)将步骤2)获得的所述冻肽DNA序列连接到带Nisin抗性基因nisr的表达载体，从而构建所述抗冻肽的表达质粒；4)将步骤3)获得的所述抗冻肽的表达质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞，利用Nisin抗性基因筛选表达所述抗冻肽的乳酸乳球菌，从而获得可以表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。优选地，所述步骤1)中，所述抗冻肽编码基因序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述步骤1)中，所述克隆载体为pUC57载体。优选地，所述步骤3)中，所述表达载体为带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌表达载体pNZ8149。优选地，所述步骤4)中，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌表达菌株NZ3900的感受态细胞。优选地，所述步骤4)中，通过转化平板筛选和确定阳性克隆菌株，然后挑选阳性克隆菌落，进行PCR鉴定和提取质粒测序，从而验证成功构建表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。优选地，所述步骤4)中，PCR鉴定步骤中，PCR鉴定引物对如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二方面，提供了一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统，所述表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统使用本专利技术第一方面所述的方法构建而得。在另一优选例中，所述表达系统为乳酸乳球菌表达菌株NZ3900。本专利技术的第三方面，提供了一种制备抗冻肽的的方法，所述方法使用本专利技术第二方面所述的表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽。优选地，所述方法还包括步骤：利用Nisin作为诱导剂诱导所述表达食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽；更优选地，诱导Nisin浓度为20-50ng/ml(较佳地为25ng/ml)。在另一优选例中，所述方法包括步骤：将本专利技术第二方面的表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统培养至对数生长初期，然后调节pH至5-6，加入诱导剂Nisin(浓度20-50ng/mL)，在30-40℃继续培养6h。在本专利技术的一个优选地实施方式中，按照乳酸乳球菌密码子偏好性进行优化的抗冻肽核苷酸序列为：ccatgggtTGTAAAGGTGCGGATGGAGCCCACGGAGTTAATGGGTGCCCTGGCACCGCTGGGGCTGCAGGCAGCGTAGGTGGGCCTGGATGCGACGGAGGCCACGGTGGTAATGGAGGCAACGGTAATCCGGGCTGTGCCGGTGGCGTCGGCGGTGCGGGAGGGGCGAGTGGCGGGACTGGAGTTGGGGGTCGAGGCGGCAAAGGTGGCTCGGGAACACCGAAAGGTGCGGACGGCGCGCCGGGCGCTCCTTGTAAGGGGGCCGACGGAGCACATGGTGTCAACGGATGTCCGGGGACTGCCGGCGCAGCAGGTTCTGTCGGAGGACCTGGCTGTGACGGTGGCCACGGCGGCAATGGAGGTAATGGGAATCCGGGTTGTGCAGGGGGAGTTGGCGGAGCGGGGGGCGCAAGCGGAGGAACAGGAGTAGGCGGCAGAGGAGGAAAAGGTGGCTCGGGAACGCCAAAAGGCGCTGATGGCGCCCCTGGTGCCCCGCATCATCATCATCATCACTAAGAGCTC(SEQIDNO.1)在本专利技术的一个优选地实施方式中，上游酶切位点NcoI，下游酶切位点SacI，基因合成构建于pUC57载体(克隆载体)上。在本专利技术的一个优选地实施方式中，采用双酶切，连接，转化技术，构建上述基因的乳酸杆菌表达载体，载体选用含有NisinA启动子的pNZ8149。在本专利技术的一个优选地实施方式中，通过电转化将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900。本专利技术所述的将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900中，NZ3900感受态的制备包括以下步骤：(1)取出-80℃冰箱保存甘油冻存管，转接到5mLG/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养24h；(2)将上述5mL培养物转接到50mLG/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养24h；(3)将上述50mL培养物转接到400mLG/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养约3h，直至OD600nm达到0.2；(4)上述培养物，6000rpm，4℃离心20min，收集菌体；(5)400mL缓冲液(0.5Msucrose,10％glycer本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：1)将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；2)克隆并提取步骤1)获得的重组质粒，酶切后获得所述抗冻肽DNA序列；3)将步骤2)获得的所述冻肽DNA序列连接到带Nisin抗性基因nis

【技术特征摘要】
1.一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：1)将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；2)克隆并提取步骤1)获得的重组质粒，酶切后获得所述抗冻肽DNA序列；3)将步骤2)获得的所述冻肽DNA序列连接到带Nisin抗性基因nisr的表达载体，从而构建所述抗冻肽的表达质粒；4)将步骤3)获得的所述抗冻肽的表达质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞，利用Nisin抗性基因筛选表达所述抗冻肽的乳酸乳球菌，从而获得可以表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述抗冻肽编码基因序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述克隆载体为pUC57载体。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述表达载体为带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌表达载体pNZ8149。5.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金鸿，张莉，罗静，金泉，谢凡，兰小红，王正武，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31