DHFR基因多态性检测体系及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种DHFR基因多态性检测体系，包括检测引物对、检测探针和肽核酸，检测引物对包括检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的外侧上下游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的内侧上下游引物，检测探针包括野生型探针和纯合子探针，肽核酸包括与内侧上游引物部分互补的肽核酸和与内侧下游引物部分互补的肽核酸本发明专利技术的DHFR基因多态性检测体系及其试剂盒，可对DHFR基因C829T多态位点进行检测，灵敏度高、特异性强、快捷方便。

DHFR gene polymorphism detection system and its reagent kit

The invention relates to a DHFR gene polymorphism detection system, including the detection of primers, probes and peptide nucleic acid detection, detection of the medial lateral primers including the detection of DHFR gene C829T polymorphism on the outside of the downstream primer, detection of DHFR gene C829T polymorphism on the inner side of the downstream primer, detection probe and probe comprises a wild type homozygote peptide nucleic acid probe, including peptide nucleic acid primer complementary and medial part and the medial part of the peptide nucleic acid primers complementary to the DHFR gene polymorphism detection system and kit to detect the DHFR gene C829T polymorphism, high sensitivity, strong specificity, fast and convenient.

【技术实现步骤摘要】
DHFR基因多态性检测体系及其试剂盒
本专利技术涉及一种基因多态性的检测产品以及该产品所用到的引物、探针、检测体系，属于生物

技术介绍
基因组DNA在某一特定的核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失，并且其在群体中出现的频率≥1％，称为单核苷酸多态性(SNP)，基因多态性与某些基因组DNA的修复功能有关，多态性可以显著影响个体对药物的敏感性，分子水平的疾病诊断可对肿瘤个体化治疗和预后判断提供指导。氢叶酸还原酶(DHFR)是甲氨蝶呤(MTX)靶标酶，DHFR是细胞内叶酸代谢的关键酶，MTX抗肿瘤作用的基本原理是竞争性结合DHFR，使二氢叶酸不能被还原成四氢叶酸。研究发现DHFR基因多态性829位点发生C>T突变，而后两者导致了DHFR蛋白质结构的改变，进而影响DHFR与MTX结合的空间结构，最终引起DHFR和MTX亲和力的下降，提高了细胞的抗药性，DHFR的C829T单核苷酸多态性检测，有助于临床医生制定更具针对性的个体治疗方案，获得较佳效果的同时也减轻患者的经济与身体负担。目前主要测采用一代测序、FLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、等位基因特异的PCR和基因芯片等技术，但是操作过程繁琐，需要更换反应管而易发生污染，多需要电泳和多步后处理，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。传统的巢式PCR反应由于有2次PCR扩增，不但耗时、开管操作极易造成交叉污染导致假阳性及结果的不准确性，而检测结果需要电泳及凝胶成像系统才能看到结果，从而降低了扩增多个靶点的可能性，从PCR到检测结果出来大约需要5h，主要应用于分子生物学领域和医学检测研究中。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能在样本初始模板量低的条件下准确检测出样本基因DHFR的C829T多态位点的基因型的DHFR基因多态性检测试剂盒，以及该试剂盒所用的检测体系。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：1、一种DHFR基因多态性检测体系，包括检测引物对、检测探针和肽核酸，所述检测引物对包括检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的外侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的外侧下游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的内侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的内侧下游引物；所述外侧上下游引物引入脱氧次黄嘌呤；所述检测探针包括检测DHFR基因C829T多态性位点为野生型的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的野生型探针和检测DHFR基因C829T多态性位点为纯合子的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的纯合子探针；所述野生型探针和纯合子探针引入脱氧次黄嘌呤和错配碱基；所述肽核酸包括与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧上游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸和与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧下游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸。上述DHFR基因多态性检测体系还包括内参引物对、内参探针、质控引物对和质控探针；所述内参引物上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示；所述质控上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述质控下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。上述各个探针的5’端设有荧光报告基团，所述各个探针的3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团是FAM、HEX、ROX或Cy5，所述荧光淬灭基团是BHQ1、BHQ2或TAMRA。上述外侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.05μm/l，所述内侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.19μm/l，所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1nm/l，所述野生型探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述纯合子探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l；所述质控引物对在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述内参引物对在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述内参探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述质控探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l。上述DHFR基因多态性检测体系还包括甲酰胺，反应体系中加入甲酰胺的体积是反应体系总体积的12％。本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系的DHFR基因多态性检测产品。本专利技术为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种DHFR基因多态性检测试剂盒，包括PCR检测液、质控检测液、阳性对照和阴性对照；所述PCR检测液包括检测引物对、检测探针和肽核酸；所述检测引物对包括检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的外侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的外侧下游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的内侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的内侧下游引物；所述外侧上下游引物引入脱氧次黄嘌呤；所述检测探针包括检测DHFR基因C829T多态性位点为野生型的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的野生型探针和检测DHFR基因C829T多态性位点为纯合子的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的纯合子探针；所述野生型探针和纯合子探针引入脱氧次黄嘌呤和错配碱基；所述肽核酸包括与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧上游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸和与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧下游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸；所述质控检测液包括内参引物对、内参探针、质控引物对和质控探针；所述内参引物上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示；所述质控上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述质控下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示；所述阳性对照液是浓度为野生型质粒和纯合子质粒的混合溶液；所述阴性对照液是浓度为不含DHFR基因野生型、杂合子和纯合子的质粒溶液。上述PCR检测液和质控检测液中还包括PCR缓冲液、2.5mM的dNTPs和5U/μl的TaqDNA聚合酶；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl、15mM的KCl和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR缓冲液的Tris-HCl缓冲液的pH值为8.3；所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP。上述外侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.05μm/l，所述内侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.19μm/l，所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1nm/l，所述野生型探针在反应体系中的最终浓度为0.1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：包括检测引物对、检测探针和肽核酸，所述检测引物对包括检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的外侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的外侧下游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的内侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的内侧下游引物；所述外侧上下游引物引入脱氧次黄嘌呤；所述检测探针包括检测DHFR基因C829T多态性位点为野生型的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的野生型探针和检测DHFR基因C829T多态性位点为纯合子的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的纯合子探针；所述野生型探针和纯合子探针引入脱氧次黄嘌呤和错配碱基；所述肽核酸包括与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧上游引物部分互补的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的肽核酸和与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧下游引物部分互补的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的肽核酸。...

【技术特征摘要】
1.一种DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：包括检测引物对、检测探针和肽核酸，所述检测引物对包括检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的外侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点外侧的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示的外侧下游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示的内侧上游引物、检测DHFR基因C829T多态性位点内侧的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示的内侧下游引物；所述外侧上下游引物引入脱氧次黄嘌呤；所述检测探针包括检测DHFR基因C829T多态性位点为野生型的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示的野生型探针和检测DHFR基因C829T多态性位点为纯合子的核苷酸序列如SEQIDNo.8所示的纯合子探针；所述野生型探针和纯合子探针引入脱氧次黄嘌呤和错配碱基；所述肽核酸包括与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧上游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示的肽核酸和与检测DHFR基因C829T多态性位点的内侧下游引物部分互补的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示的肽核酸。2.根据权利要求1所述的DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：还包括内参引物对、内参探针、质控引物对和质控探针；所述内参引物上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.9所示，所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示；所述质控上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.12所示，所述质控下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.13所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。3.根据权利要求2所述的DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：所述各个探针的5’端设有荧光报告基团，所述各个探针的3’端设有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团是FAM、HEX、ROX或Cy5，所述荧光淬灭基团是BHQ1、BHQ2或TAMRA。4.根据权利要求2所述的DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：所述外侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.05μm/l，所述内侧上下游引物在反应体系中的最终浓度0.19μm/l，所述肽核酸在反应体系中的最终浓度为1nm/l，所述野生型探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述纯合子探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l；所述质控引物对在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述内参引物对在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述内参探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l，所述质控探针在反应体系中的最终浓度为0.19μm/l。5.根据权利要求1或2所述的DHFR基因多态性检测体系，其特征在于：还包括甲酰胺，反应体系中加入甲酰胺的体积是反应体系总体积的12%。6.一种采用如权利要求1所述的检测体系的DHFR基因多态性检测产品。7.一种DHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包括PCR检测液、质控检测液、阳性对照和阴性对照；所述PCR检...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵会，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31