禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌等的五重PCR检测方法及检测试剂盒技术

技术编号:16298850 阅读:25 留言:0更新日期:2017-09-26 17:12
本发明专利技术提供了一种禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重PCR引物组、包括该引物组的五重PCR检测试剂盒以及五重PCR检测方法。引物组包括:特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对ECphoA‑F和ECphoA‑R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SGglgC‑F和SGglgC‑R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGPspeC‑F和SGPspeC‑R;特异性扩增肠炎沙门菌sdf Ⅰ基因的引物对SEsdf Ⅰ‑F和SEsdf Ⅰ‑R;特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对STstm4495‑F和STstm4495‑R。

Avian E. coli, Salmonella typhi, Salmonella pullorum five PCR detection method and detection kit

The invention provides a poultry Chicken Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella pullorum, Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium by multiplex PCR primer pairs, including the primer set five PCR detection kit and detection method of PCR five. A primer set includes: specific primers of avian Escherichia coli phoA gene of ECphoA F and ECphoA R; specific primers of glgC gene of chicken Salmonella typhi SGglgC F and SGglgC R; specific primers of chicken Salmonella typhimurium and Salmonella pullorum speC gene of SGPspeC F and SGPspeC R specific primer; Salmonella enteritidis SDF gene of SEsdf F and SEsdf 1 1 R; specific primers of Salmonella typhimurium stm4495 gene of STstm4495 F and STstm4495 R.

【技术实现步骤摘要】
禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌等的五重PCR检测方法及检测试剂盒
本专利技术属于生物
,具体涉及一种用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重PCR引物组、包括该引物组的五重PCR检测试剂盒以及利用该引物组的五重PCR检测方法。
技术介绍
随着规模化养禽业的快速发展,疫病的发生和流行也相应增加,导致养禽业经济效益下降。重要的细菌性传染病如禽大肠杆菌病、鸡白痢、鸡伤寒等重要细菌病严重危害养禽业。目前,国内主要依靠抗生素防治细菌病,但由于长期、不合理地使用抗生素导致:一方面产生广泛的耐药性,另一方面药物残留直接影响了动物产品的安全。因此,加强对这些细菌性疾病的长期监测和研究,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。国内外对细菌性疾病的诊断和监测技术种类繁多,主要包括:细菌分离培养及生化鉴定、分子生物学技术、免疫学技术等。PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用。目前,针对禽大肠杆菌和不同血清型沙门菌建立了多种检测方法,然而,没有针对禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的快速检测及鉴别诊断PCR方法。
技术实现思路
为了解决上述问题,本专利技术采用了如下技术方案:本专利技术的一个目的是提供一种能够准确、快速、稳定、特异性和灵敏性高的检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的引物组,其特征在于,包括:特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对ECphoA-F和ECphoA-R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SGglgC-F和SGglgC-R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R;特异性扩增肠炎沙门菌sdfⅠ基因的引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R;特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对STstm4495-F和STstm4495-R,各个引物的核苷酸序列分别为:ECphoA-F,5’-GGCAATACACTCACTATGCGCTG-3’,ECphoA-R,5’-AGGATTCGCAGCATGATCCTG-3’;SGglgC-F,5’-CGTCGCTATAAAGCGGAATATGTC-3’,SGglgC-R,5’-CCTTTTCAAAACATACGCGAGTAG-3’;SGPspeC-F,5’-GTTGCCGTACCGGTCGTAACG-3’,SGPspeC-R,5’-TTCCTGACGGGCATCGACGGC-3’;SEsdfⅠ-F,5’-GATGTGGTTGGTTCGTCACTG-3’,SEsdfⅠ-R,5’-GCGAGACCTCAAACTTACTCAG-3’;STstm4495-F,5’-CAGCGGTATGATGCGGTAGT-3’,STstm4495-R,5’-TCACCGGTGGACATGCCTGC-3’。本专利技术提供的引物组,还具有这样的特征:引物对ECphoA-F和ECphoA-R用于扩增的目的片段的大小为761bp;引物对SGglgC-F和SGglgC-R用于扩增的目的片段的大小为83bp;引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R用于扩增的目的片段的大小为249bp;引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R用于扩增的目的片段的大小为409bp;引物对STstm4495-F和STstm4495-R用于扩增的目的片段大小为569bp。本专利技术的另一个目的是提供一种五重PCR检测试剂盒,用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌,其特征在于,包括:用于建立PCR反应体系的2×PCR预混液和引物组,其中,PCR反应体系用于引物组中的各个引物对进行特异性扩增,引物组上述的引物组。本专利技术提供的五重PCR检测试剂盒,还具有这样的特征:其中,2×PCRPreMix的体积为12.5μL,在引物组中,引物对ECphoA-F和ECphoA-R的体积各为0.5μL,引物对SGglgC-F和SGglgC-R的体积各为0.2μL,引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R的体积各为0.3μL,引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R的体积各为0.4μL、引物对STstm4495-F和STstm4495-R的体积各为0.5μL。本专利技术的再一个目的是提供一种检测禽大肠杆菌、鸡伤寒门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的五重PCR检测方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1,基于待检测细菌制备得到PCR模板;步骤2,制备特异性引物组,采用权利要求1或2中任意一项的引物组制备得到特异性引物组;步骤3,进行PCR扩增反应,基于步骤1得到的PCR模板,采用步骤2得到的特异性引物组建立得到包括的引物组的PCR反应体系,然后采用该PCR反应体系在预定PCR反应参数条件下进行PCR扩增反应得到PCR扩增产物;步骤4,进行电泳检测,对扩增产物进行电泳检测得到电泳结果,根据电泳结果判定是否出现禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:步骤1中得到的PCR模板为待检测细菌的菌液,具体过程为:将待检测细菌的菌株接种至LB液体培养基,在温度为37℃的条件下培养至OD600=1.0,得到的菌液即为PCR模板。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:步骤1中得到的PCR模板为细菌粗提DNA,具体过程为:将待检测细菌的菌株接种至LB液体培养基,在温度为37℃的条件下培养至OD600=1.0,得到菌液,然后将1mL该菌液在10000-12000r/min下离心1-2min,去上清,加0.1-0.5mL灭菌超纯水重悬,煮沸5-10min,然后在10000-12000r/min下离心3-5min,得到的上清即为细菌粗提DNA。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:步骤3的PCR反应体系包括:12.5μL的2×PCRPreMix,1.0μL的模板、7.7μL的超纯水,和引物组,在引物组中,引物对ECphoA-F和ECphoA-R的体积各为0.5μL,引物对SGglgC-F和SGglgC-R的体积各为0.2μL,引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R的体积各为0.3μL,引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R的体积各位0.4μL、引物对STstm4495-F和STstm4495-R的体积各为0.5μL。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:制备特异性引物组时,引物组中使用的各个引物的浓度为10pM,将使用的各个引物的稀释液置于-20℃保存后再用。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:预定PCR反应参数条件为95℃预变性5min;95℃下30s,57℃下30s,72℃下50s,进行35个循环;72℃,10min。本专利技术提供的五重PCR检测方法,还具有这样的特征:步骤4的具体过程为,取10μLPCR扩增产物,点样于2.0%琼脂糖凝胶电泳板孔中,在80-100V电压下,电泳30-40min,于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果,对电泳结果进行判定的前提条件为阴性对照无任何条带出现,当电泳结果出现761bp条本文档来自技高网...
禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌等的五重PCR检测方法及检测试剂盒

【技术保护点】
一种用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重PCR的引物组,其特征在于,包括:特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对ECphoA‑F和ECphoA‑R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SGglgC‑F和SGglgC‑R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGPspeC‑F和SGPspeC‑R;特异性扩增肠炎沙门菌sdfⅠ基因的引物对SEsdf Ⅰ‑F和SEsdf Ⅰ‑R;特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对STstm4495‑F和STstm4495‑R,各个引物的核苷酸序列分别为:ECphoA‑F,5’‑GGCAATACACTCACTATGCGCTG‑3’,ECphoA‑R,5’‑AGGATTCGCAGCATGATCCTG‑3’;SGglgC‑F,5’‑CGTCGCTATAAAGCGGAATATGTC‑3’,SGglgC‑R,5’‑CCTTTTCAAAACATACGCGAGTAG‑3’;SGPspeC‑F,5’‑GTTGCCGTACCGGTCGTAACG‑3’,SGPspeC‑R,5’‑TTCCTGACGGGCATCGACGGC‑3’;SEsdfⅠ‑F,5’‑GATGTGGTTGGTTCGTCACTG‑3’,SEsdfⅠ‑R,5’‑GCGAGACCTCAAACTTACTCAG‑3’;STstm4495‑F,5’‑CAGCGGTATGATGCGGTAGT‑3’,STstm4495‑R,5’‑TCACCGGTGGACATGCCTGC‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的多重PCR的引物组,其特征在于,包括:特异性扩增禽大肠杆菌phoA基因的引物对ECphoA-F和ECphoA-R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌glgC基因的引物对SGglgC-F和SGglgC-R;特异性扩增鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌speC基因的引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R;特异性扩增肠炎沙门菌sdfⅠ基因的引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R;特异性扩增鼠伤寒沙门菌stm4495基因的引物对STstm4495-F和STstm4495-R,各个引物的核苷酸序列分别为:ECphoA-F,5’-GGCAATACACTCACTATGCGCTG-3’,ECphoA-R,5’-AGGATTCGCAGCATGATCCTG-3’;SGglgC-F,5’-CGTCGCTATAAAGCGGAATATGTC-3’,SGglgC-R,5’-CCTTTTCAAAACATACGCGAGTAG-3’;SGPspeC-F,5’-GTTGCCGTACCGGTCGTAACG-3’,SGPspeC-R,5’-TTCCTGACGGGCATCGACGGC-3’;SEsdfⅠ-F,5’-GATGTGGTTGGTTCGTCACTG-3’,SEsdfⅠ-R,5’-GCGAGACCTCAAACTTACTCAG-3’;STstm4495-F,5’-CAGCGGTATGATGCGGTAGT-3’,STstm4495-R,5’-TCACCGGTGGACATGCCTGC-3’。2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于:引物对ECphoA-F和ECphoA-R用于扩增的目的片段的大小为761bp;引物对SGglgC-F和SGglgC-R用于扩增的目的片段的大小为83bp;引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R用于扩增的目的片段的大小为249bp;引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R用于扩增的目的片段的大小为409bp;引物对STstm4495-F和STstm4495-R用于扩增的目的片段大小为569bp。3.根据权利要求1或2中任意一项权利所述的引物组在制备用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的五重PCR检测试剂盒中的应用。4.一种五重PCR检测试剂盒,用于检测禽大肠杆菌、鸡伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌,其特征在于,包括:用于建立PCR反应体系的2×PCR预混液和引物组,其中,所述PCR反应体系用于所述引物组中的各个引物对进行特异性扩增,所述引物组为权利要求1或2中任意一项所述的引物组。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于:其中,所述2×PCRPreMix的体积为12.5μL,在所述引物组中,引物对ECphoA-F和ECphoA-R的体积各为0.5μL,引物对SGglgC-F和SGglgC-R的体积各为0.2μL,引物对SGPspeC-F和SGPspeC-R的体积各位0.3μL,引物对SEsdfⅠ-F和SEsdfⅠ-R的体积各位0.4μL、引物对STstm4495-F和STstm4495-R的体积各为0.5μL。6.一种检测禽大肠杆菌、鸡伤寒门菌、鸡白痢沙门菌、肠炎...

【专利技术属性】
技术研发人员:于圣青王少辉梁华吴晓君丁铲
申请(专利权)人:中国农业科学院上海兽医研究所
类型:发明
国别省市:上海,31

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