一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法技术

本发明专利技术公开了一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法，属于微生物生产利用领域。本发明专利技术在白酒酒醅入窖池发酵之前加入罗伊氏乳杆菌或其粗酶液，酒醅中EC的重要前体物质尿素的含量减少了100％，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其酶液，则基本没有效果。本发明专利技术采用的罗伊氏乳杆菌是食品安全菌，应用到酒醅中不会产生其它有害物质。本发明专利技术提供的方法具有良好的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法
本专利技术涉及一种降低浓香型白酒酒醅中尿素的方法，属于微生物生产利用领域。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)被世界卫生组织归为2A类致癌物质，与丙稀 胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾病。氨基甲酸乙酯广 泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油等食品。此前检测到中国白酒中含有氨基甲酸乙 酯，长期过量饮用会增加致癌几率。而国内对白酒中氨基甲酸乙酯的降低方法未见报道。我 国是白酒消费大国，消耗量巨大，人们日常饮用量较大，次数较多。白酒中中氨基甲酸乙酯 前体物质主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。对中国江苏一家白酒厂的浓香型白酒研究结果表明： 入窖酒醅中尿素含量为20-30mg/kg，粮食原料中也会带有尿素，含量为51.5mg/kg。基于国 人的健康考虑，及早地开展研究，降低白酒酒醅中尿素，减少健康隐患，势在必行。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯前体物质尿 素的方法，是在酒醅入窖发酵之前加入罗伊氏乳杆菌和/或罗伊氏乳杆菌所产的脲酶，降低 白酒酒醅中尿素的含量。 在本专利技术的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌是在酒醅入窖发酵之前加入，使 酒醅中罗伊氏乳杆菌的浓度达到IO7~l〇 8CFU/g。 在本专利技术的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌所产的脲酶是以粗酶液的形式在 酒醅入窖发酵之前加入，使酶活达到是〇.19U/g。 在本专利技术的一种实施方式中，所述罗伊氏乳杆菌选用Lactobacillus reuteri，购 买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6124。 在本专利技术的一种实施方式中，所述白酒可以是浓香型白酒。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：（1)菌种活化；（2)粗酶液制 备:将培养好的菌液用洗涤悬浮，破壁，收集破壁液上清中的粗酶液；（3)发酵:取入窖大茬 酒醅，加入菌液或的粗酶液，发酵酿酒。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：（1)菌种活化:罗伊氏乳杆 菌接入MRS培养基，30 °C厌氧培养72h; (2)粗酶液制备:将培养好的菌液用20mM，pH7.0的PBS 缓冲液洗涤悬浮，加入直径〇 . Imm的玻璃珠，进行机械破碎，1000 Orpm离心10分钟，取上清 液，即为粗酶液；（3)发酵:取入窖大茬酒醅，加入用生理盐水悬浮的菌液或制备好的粗酶 液，搅拌均勾，30 °C厌氧发酵15天。本专利技术在白酒酒醅入窖池发酵之前加入罗伊氏乳杆菌或其粗酶液，酒醅中EC的重 要前体物质尿素的含量减少了100%，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其 酶液，则基本没有效果。本专利技术采用的罗伊氏乳杆菌是食品安全菌，应用到酒醅中不会产生 其它有害物质。【附图说明】 图1单菌株和商品脲酶对酒醅中尿素的降解效果;A不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡 萄球菌及其菌液的对照组的起始状态;B不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌液的 对照组的发酵终了状态;C罗伊氏乳杆菌;D腐生葡萄球菌M3;E腐生葡萄球菌M26;F腐生葡萄 球囷M39;G商品脈酶。 图2不同粗酶液和商品脲酶对酒醅中尿素的降解效果;A不添加罗伊氏乳杆菌或腐 生葡萄球菌及其菌液的对照组的起始状态;B不添加罗伊氏乳杆菌或腐生葡萄球菌及其菌 液的对照组的发酵终了状态;C罗伊氏乳杆菌;D腐生葡萄球菌M3; E腐生葡萄球菌M26; F腐生 葡萄球菌M39;G商品脲酶。【具体实施方式】脲酶活性检测方法： 测量所需试剂： 显色剂I:将30g苯酚和1.25g亚硝基铁氰化钠溶于超纯水，定容至500mL。 显色剂II:将26.25g氢氧化钠和15mL次氯酸钠溶于超纯水，定容至500mL。 终止剂:称取50g三氯乙酸溶于超纯水，定容至500mL。 酶活定义:在常压、37°C、pH 7.0的条件下，每分钟分解尿素生成Ιμπιο?氨为一个酶 活力单位(U)。 测定原理:脲酶降解尿素生成二氧化碳和NH3,根据NH3与苯酚-次氯酸钠的显色反 应，于分光光度计625nm处测量OD值，根据NH 3的生成量计算酶活。 测量方法:取ImL粗酶液和ImL超纯水，各加入ImL 4%的尿素溶液。37°C恒温水浴 反应15min后加入ImL 10%三氯乙酸终止反应，震荡混匀。加入ImL的显色剂I和显色剂II， 混匀后于37°C水浴20min。显色反应结束后用超纯水稀释至10mL，于分光光度计625nm处测 定吸光值。 酶活计算公式:酶活式中AOD625为样品与空白对照吸光值之差，η为酶液稀释倍数，k为标准曲线斜率 倒数，15为反应的时间(min)。白酒酒醅中尿素含量的检测： 样品处理:取发酵后酒醅20g，用30mL超纯水溶解，超声30min，离心，取上清液400μ 1，加入600μ1 0.02mol/L占顿醇，再加入100yll.5mol/L HC1，避光反应30min。反应后样品 过0 · 22um滤头过滤后进样检测。检测条件:安捷伦液相色谱仪Agilent 1260(美国安捷伦公司）；分析方法:采用占 顿醇在酸性避光条件下与尿素发生衍生化反应，通过FLD检测衍生化产物，得到尿素含量。 色谱柱:Gemini-NX 5u C18110A(250X4.6mm)，柱温:35°C;流速荧光检测器:λ 6叉=213]1111，人6111 = 308111]1。流动相八相：称取1.64(^无水乙酸钠于10001111^烧杯中，加入10001111^ 超纯水溶解，将pH调至7.20,过0.22μπι水系滤膜，超声15min备用；流动相Β:纯乙腈(HPLC); 流动相C:取500mL超纯水过0.22μπι水系滤膜，备用。梯度洗脱程序见表1。表1流动相之间的比例及时间实施例1白酒酿制流程 五粮(大米、糯米、玉米、小麦、高粱，比例为24:18:10:11:17)加水润料后，加入出 窖大茬酒醅，混匀后入甑蒸馏出酒，摊晾，加水(90°C)，待温度降至常温（18~19°C)，拌入大 曲，同时分别加入腐生葡萄球菌、罗伊氏乳杆菌或者粗酶液或者商品脲酶(商品脲酶购买自 生物工程（上海）股份有限公司，编号A003885，生产厂家Worthington Biotecnical Corperation)，腐生葡萄球菌接种量为IO7~IO8CFlVg，罗伊氏乳杆菌接种量为IO 7~ IO8CFlVg，腐生葡萄球菌的酶液加入量为43.9~45.6U/g，罗伊氏乳杆菌的酶液加入量为 0.19U/g，商品脲酶的加入量为0.19U/g。以不加菌株或酶为对照，设置3个平行样，每个质量 100g。控温30°C，厌氧发酵70天，取发酵15天样品测定尿素含量。 实施例2白酒酒醅中尿素含量与加入不同菌株的关系 (1)腐生葡萄球菌和罗伊氏乳杆菌浓菌液准备 3株腐生葡萄球菌（腐生葡萄球菌从白酒大曲中筛选，分别是Staphylococcus saprophyt i cus strain M3、Staphylococcus saprophyt i cus strain M26、 Staphylococcus saprophyticus strain M39)接入发酵培养基（ρΗ6·8)，30°C220rpm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，其特征在于，是在酒醅入窖发 酵之前加入罗伊氏乳杆菌和/或罗伊氏乳杆菌所产的脲酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氨基甲酸乙酯前体物质是尿素。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌是在酒醅入窖发酵之前 加入，使酒醅中罗伊氏乳杆菌的浓度达到1〇 7~l〇8CFU/g。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌所产的脲酶是以粗酶液 的形式在酒醅入窖发酵之前加入，使酶活达到〇.19U/g。5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：（1)菌种活 化；（2)粗酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，孟庆达，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：