核酸扩增用基材以及核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供一种核酸扩增用基材，其能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测。本发明专利技术的核酸扩增用基材具有阵列化的多个分区，在该分区中保持有亲水性凝胶，所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸扩增用基材以及核酸扩增方法
本专利技术涉及核酸扩增用基材及其制造方法、以及使用了该基材的核酸扩增方法等。
技术介绍
以人为首的各种生物的基因组等的核酸序列解析正在全力推进中，近年来，大规丰旲测序、基因筛选等基因解析技术也在迅速提闻。此外，还鉴定出多种与疾病、药理相关的基因标记，利用这些基因标记的新的诊断、检查方法已经开始实用化。这些基因解析、诊断/检查中，大多对作为解析对象的靶核酸序列进行扩增，作为扩增方法，通常使用PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)法、LAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,环介导等温扩增)等。关于这些核酸扩增方法，为了应用于大规模测序、基因筛选等中，提出了用于独立且全面地扩增非特定序列的方法、设备。此外，为了提高检查及诊断等的效率，还提出了用于独立地扩增多种特定序列的方法、设备。作为前者的例子，设计了在由贯穿微型板内外的毛细管形成的孔的内部实施PCR的方法(专利文献I)。根据本方法，将形成有多个毛细管状的孔的微型板浸溃在PCR溶液中，按照使各孔中包含的靶核酸为一分子的方式进行反应，从而能够在各个孔中独立地对一条靶核酸进行扩增。此外，还提出了不使用微型板的方法(专利文献2)。该方法的特征在于，将实现了含有一分子靶核酸的、含有PCR溶液的多个微小液滴凝胶，以在油等疏水性溶剂中调制为胶乳的状态供于PCR扩增反应。另一方面，作为后者的例子，可以列举多重PCR(Multiplex PCR)法。通常的PCR法中，在I种反应溶液中使用I种引物组来进行靶碱基序列的扩增，而多重PCR法中，在I个反应容器中使用扩增对象不同的多个引物组来进行多种靶碱基序列的扩增。与此相反地，还提出了将多种引物对配置在各自独立的微细空间内、在该微细空间中分别进行PCR的方法(专利文献3)。根据本方法，准备排列有多根毛细管、滴加有多种引物对并使其干燥的基板，通过使该基板接触并吸入不含引物对的PCR溶液从而使引物对再溶解，能够在各毛细管中独立地进行使用不同种类引物的PCR。进而，还设计了将多种引物对的末端固定在基板上并进行阵列化后，一次性进行多条靶核酸序列的扩增的方法(非专利文献I)。根据该方法，将在靶序列特异性引物的5’末端侧附加有任意的通用接头序列的引物组固定在基板上，进而在液相中添加该通用接头序列作为引物，从而对于本来仅通过固定在基板上的引物难以扩增的核酸也能够进行扩增及检测。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2002-335960号公报专利文献2:日本特开2008-245612号公报专利文献3:日本特开2008-154490号公报非专利文献非专利文献I =Nucleic Acids Research, 2005，Vol.33，N0.2ell
技术实现思路
专利技术所要解决的课题但是，这些现有技术难以不使多种靶序列混合并高通量地进行扩增。例如，专利文献I记载的技术中，由于无法在一种反应溶液中使用多种引物，因此难以对多种特定序列进行扩增。此外，使用的是在毛细管中吸上了 PCR溶液的试样，在本来体积就微小的毛细管中会立即干燥，被认为结果的再现性不高。专利文献2记载的技术中，虽然能够扩增的片段数极多，但与专利文献I记载的技术同样地无法在一种反应溶液中(一个微小液滴凝胶中)使用多个引物对。此外，不仅在扩增反应后进行检测时胶乳中的微 小液滴凝胶的操作必须慎之又慎，而且各微小液滴凝胶中包含的扩增产物的种类也不明确，因此需要另外通过测序进行鉴定，因而需要高端的技术、昂贵的装置，因此难以实用化。专利文献3记载的技术中，虽然能够使用多种引物对分别实施PCR，但是，引物本身仅仅简单地被干燥固着在各分区中，因此在接触PCR溶液时，毛细管的开放部通过水系溶液而被连接，溶解了的引物对发生混合，产生不希望的扩增产物的可能性很高。此外，在检测扩增产物时，需要从毛细管中回收PCR溶液。在无需回收的实验体系中，在检测时需要设法使PCR溶液不从毛细管泄露且不会干燥，诸如此类，操作繁杂。非专利文献I记载的技术中，虽然与使用固定有引物的载体的PCR相比扩增效率提高，但PCR初期的反应仅在固相中进行，因此与水相中的PCR相比，扩增效率低，反应需要更多时间。此外，由于在液相中使用通用引物，因此，样品中本来就大量存在的靶核酸序列的扩增使用了大量通用引物，存在无法对初始量少的靶核酸序列进行检测的可能性。即，根据数量比的不同，有可能存在没有被扩增的靶核酸序列。因此，本专利技术的目的在于提供一种核酸扩增用基材以及使用了该基材的核酸扩增方法等，所述核酸扩增用基材能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测。用于解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，使用下述基材能够正确且高效地对作为检测对象的多个靶核酸序列进行扩增、检测，从而完成了本专利技术，所述基材具有阵列化的多个分区，所述分区由通过加热而溶解的亲水性凝胶保持不同种类的核酸扩增用引物对和聚合酶及缓冲液成分。SP，本专利技术如下所述。(I) 一种核酸扩增用基材，其具有阵列化的多个分区，在该分区中保持有通过加热能够溶解的亲水性凝胶，所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物对、聚合酶及缓冲液成分。上述⑴所述的基材中，各分区中引物的浓度可以是例如I~lOOOfmol/μ L。此外，缓冲液成分可以含有例如选自由KC1、Tris-HCl, MgCl2,明胶及TritonX-100组成的组中的至少I种。此外，亲水性凝胶(通过加热能够溶解的亲水性凝胶)可以是使用选自由琼脂糖、藻酸、葡聚糖、乙烯醇及乙二醇组成的组中的至少I种作为单体成分而调制的凝胶，特别优选为琼脂糖凝胶。这里，亲水性凝胶的浓度可以为例如0.5~2质量％。上述(I)所述的基材中各分区的大小可以为例如该分区的形状的最大宽度为10 μ m ~1000 μ m。(II) 一种上述(I)所述的核酸扩增用基材的制造方法，其包括下述工序。(I)将多根中空纤维按照中空纤维的各纤维轴朝向同一方向的方式3维排列并将该排列用树脂固定，从而制造中空纤维束的工序(2)将含有引物的凝胶前体溶液导入到预先加热的中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序(3)使导入到中空纤维束的中空部的凝胶前体溶液反应，从而将含有引物的凝胶状物保持在中空纤维的中空部的工序(4)在疏水性液体中将中空纤维束在与纤维的长度方向交叉的方向上切断，从而进行薄片化的工序(III) 一种核酸扩增用试剂盒，其含有上述⑴所述的核酸扩增用基材和模板供给用基材。(IV) 一种核酸扩增方法，其包括向上述(I)所述的核酸扩增用基材的各分区供给丰吴板的工序和对该供给后的基材进行加热的工序。专利技术的效果根据本专利技术，能够不使因靶核酸序列而异的引物对相互混合地实施使用多种引物对的核酸扩增反应。此外，由于引物没有被固定在固相上，因此在通过加热使凝胶液化时引物发生游离，能够以与液相中的核酸扩增反应同等的速度实施反应。由于凝胶所具有的保水力，即使为较小的体积也难以发生干燥，PCR的稳定性提高。进而，由于不使用靶核酸序列通用的引物，因此不发生作为扩增反应对象的靶核酸序列之间的引物竞争，初始的靶核酸的数量比也不会对扩增结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸扩增用基材，其具有阵列化的多个分区，在该分区中保持有通过加热能够溶解的亲水性凝胶，所述亲水性凝胶含有用于扩增核酸的不同种类的引物对、DNA聚合酶及缓冲液成分。2.根据权利要求1所述的基材，各分区中引物的浓度为I~lOOOfmol/μL。3.根据权利要求1或2所述的基材，缓冲液成分包含选自由KCl、Tris-HCl、MgCl2,明胶及Triton X-100组成的组中的至少I种。4.根据权利要求1~3的任一项所述的基材，亲水性凝胶为使用选自由琼脂糖、藻酸、葡聚糖、乙烯醇及乙二醇组成的组中的至少I种作为单体成分而调制的凝胶。5.根据权利要求1~3的任一项所述的基材，亲水性凝胶为琼脂糖凝胶。6.根据权利要求1~5的任一项所述的基材，亲水性凝胶的浓度为0.5~2质量％。7.根据权利要求1~6的任一项所述的基材，各分区的大小是...

【专利技术属性】
技术研发人员：大岛宏之，
申请(专利权)人：三菱丽阳株式会社，
类型：发明
国别省市：