用于烷酰基辅酶a合成的基因和蛋白质制造技术

技术编号:16268182 阅读:43 留言:0更新日期:2017-09-22 20:23
鉴定和表征了具有烷酰基辅酶A活性的多肽以及编码这些多肽的核酸。核酸的表达或过表达会改变生物体中大麻素化合物的水平。所述多肽可用于体内或体外产生大麻素化合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于烷酰基辅酶A合成的基因和蛋白质相关专利申请的交叉引用本专利申请要求于2011年7月13日提交的美国临时专利申请序号USSN61/507,331的优先权,该申请以引用的方式全文并入本文。专利
本专利技术涉及与烷酰基辅酶A硫代酯的合成相关的核酸分子和蛋白质,和所述核酸分子和蛋白质用于植物、微生物或无细胞系统中的大麻素生物合成工程的用途以及用于培育具有增强或降低的大麻素含量的大麻植物的用途。_4] 专利技术背景大麻(Cannabissativa L.; cannabis, hemp, marijuana)是一种最古老且用途最广的种植植物,现今发现它可用作药品、食品、化妆品和工业产品的来源。大麻还因含有作用于精神的大麻素(如Λ9-四氢大麻酚,A9-THC)而用作非法毒品而闻名。目前正在探索作用于哺乳动物大麻素受体的大麻素和其它药物对不同病症的治疗,所述病症如慢性疼痛、多发性硬化症和癫痫。大麻素的生物合成起源于聚酮和萜类的代谢作用,他们被称为萜酚(terpenophenolic)或戍二烯聚酮(Page J., Nagel J.(2006)Biosynthesis ofterpenophenolics in hop and cannabis.1n JT Romeo,ed,Integrative PlantBiochemistry, Vol.40.Elsevier, Oxford, ppl79_210.)。大麻素生物合成主要发生在以高密度覆盖雌花的腺毛中。大麻素通过三步生物合成过程形成:聚酮的形成、芳香族异戊烯化和环化(见图1)。大麻素生物合 成中的第一个酶促步骤是戍基二羟基苯酸(olivetolic acid)的生成,其通过聚酮合成酶催化己酰辅酶A (CoA)与三分子丙二酰辅酶A的缩合形成。主要的大麻素包括P-四氢大麻酚酸和大麻二酚酸,它们由前体己酰辅酶A形成,所述前体己酰辅酶A是中链脂肪酰辅酶A (见图1)。其它含不同侧链的大麻素由不同长度脂族辅酶A形成(如Δ9-四氢次大麻酹酸(Δ9-tetrahydrocannabivarinic acid)是由正丁酰辅酶A引物(primer)形成的)。植物中己酰辅酶A和其它酰基辅酶A硫代酯通过酰基活化酶(AAE,也称为酰基辅酶A合成酶)使用ATP催化羧酸底物的活化而合成。这些酶作用于多种羧酸,包括短链、中链、长链和极长链脂肪酸、茉莉酮酸前体、苯丙素衍生酸(如肉桂酸)和其它有机酸如丙二酸、乙酸和柠檬酸。在自然界中,此前很少有已经鉴定的中链酰基辅酶A合成酶。在植物中,来自拟南芥(A.thaliana)的三种酶AAE7、At4g05160和At5g63380已证明由己酸形成己酰辅酶A(Schneider K等.(2005)A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetasefrom Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosyntheticprecursors of jasmonic acid.The Journal of Biological Chemistry 280:13962-72;Shockey JM, Fulda MS, Browse J(2003)Arabidopsis contains a large superfamilyof acy!-activating enzymes.Phylogenetic and biochemical analysis reveals anew class of acyl-coenzyme a synthetases.Plant Physiologyl32:1065-76.X 来自假单胞菌(Pseudomonas spp.)的酰基辅酶A合成酶已证明作用于中链脂肪酸如己酸(Fernandez-Valverde M, Reglero A, Martinez-Blanco H, Luengo JM(1993)Purificationof Pseudomonas putida acyl coenzyme A ligase active with a range of aliphaticand aromatic substrates.Applied Environmental Microbiology59:1149-1154.X大麻素是珍贵的天然产物。编码涉及大麻素生物合成的酶的基因将可用于大麻代谢工程,以生产含极低水平或不含THCA的植物和通过靶向诱变(如TILLING)或其它基因敲除技术生产其它大麻素。这些基因还证明可用于经由标记物辅助的选择产生特定大麻种类,以用于生产基于大麻素的药物,或可用于在异源生物体如细菌或酵母中重建大麻素生物合成,或可用于在利用重组蛋白的无细胞系统中生产大麻素。编码大麻素生物合成的酶的基因也用于大麻素类似物的合成和大麻素前体类似物的合成。在此之前,大麻素类似物已被合成并可用作药物产品。本领域仍需要鉴定涉及芳香族聚酮合成的酶和编码这些酶的核苷酸序列。
技术实现思路
已经从大麻中发现两个新基因,其编码此前未知的烷酰基辅酶A合成酶。本文提到的这两个新的烷酰基辅酶A合成酶用大麻己酰辅酶A合成酶I (CsHCSI)和大麻己酰辅酶A合成酶2 (CsHCS2)表示。因此,本专利技术第一个方面提供一种分离或纯化的核酸分子,所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少75%序列同一性的核苷酸序列或其密码子简并序列。本专利技术的第二个方面提供一种分离或纯化的核酸分子,所述核酸分子包含与SEQID NO: 3具有至少75%序列同一性的核苷酸序列或其密码子简并序列。本专利技术的第三个方面提供`一种分离或纯化的多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。本专利技术的第四个方面提供一种分离或纯化的多肽,所述多肽包含与SEQ ID N0:4具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。本专利技术的第五个方面提供一种包含本专利技术的核酸分子的载体、构建体或表达系统。本专利技术的第六个方面提供一种用本专利技术的核酸分子转化的宿主细胞。本专利技术的第七个方面提供一种在本专利技术的酶的存在下合成烷酰基辅酶A的方法。本专利技术的第八个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括使用本专利技术的核酸分子或其一部分在生物体、细胞或组织中使编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因沉默。 本专利技术的第九个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括使生物体、细胞或组织中的基团突变,并使用本专利技术的核酸分子筛选包含编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因的突变体或变体的生物体、细胞或组织。本专利技术的第十个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或过表达核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比,在所述生物体、细胞或组织中表达或过表达本专利技术的核酸分子。本专利技术的第十一个方面提供一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或过表达核酸分子的本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分尚或纯化的核酸分子,所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少75%序列同一'I"生的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQID NO:1中所示或是其密码子简并核苷酸序列。3.—种分尚或纯化的核酸分子,所述核酸分子包含与SEQ ID NO: 3具有至少75%序列同一'I"生的核苷酸序列或其密码子简并核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核酸分子,其特征在于,所述核苷酸序列如SEQID N0:3中所示或是其密码子简并核苷酸序列。5.一种分离或纯化的多肽,所述多肽包含与SEQ ID N0:2具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。6.一种分离或纯化的多肽,所述多肽包含与SEQ ID N0:4具有至少85%序列同一性的氨基酸序列或其保守性置换的氨基酸序列。7.根据权利要求5或6所述的多肽,所述多肽具有烷酰基辅酶A活性。8.一种包含权 利要求1至4中任一项所述的核酸分子的载体、构建体或表达系统。9.一种用根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子转化的宿主细胞。10.一种合成烷酰基辅酶A的方法,所述方法包括:在根据权利要求7所述的多肽的存在下使羧酸与辅酶A反应。11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述羧酸具有2到10个碳原子。12.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述烷酰基辅酶A包括己酰辅酶A。13.—种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括与在相似条件下培养但不使用用于沉默的核酸分子的相似种类的生物体、细胞或组织相比,使用根据权力要求I至4中任一项所述的核酸分子或其一部分在所述生物体、组织或细胞中使编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因沉默。14.一种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括在所述生物体、细胞或组织中突变基因,并且使用根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子筛选包含编码催化烷酰基辅酶A合成的酶的基因的突变体或变体的生物体、细胞或组织。15.—种改变生物体、细胞或组织中大麻素化合物的水平的方法,所述方法包括与在相似条件下培养但不表达或过表达外源核酸分子的相似...

【专利技术属性】
技术研发人员:乔纳森·E·佩奇詹森·M·斯托特
申请(专利权)人:加拿大国家研究委员会萨斯喀彻温大学乔纳森·E·佩奇詹森·M·斯托特
类型:发明
国别省市:

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