稳定敲低Mon1A的细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种稳定敲低Mon1A的细胞系，包括真核表达载体，所述真核表达载体包括用于抑制Mon1A表达的序列。这种稳定敲低Mon1A的细胞系，通过抑制Mon1A的mRNA的转录，以明显降低Mon1A的蛋白表达量。该稳定表达细胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞Mon1A的表达状态为研究Mon1A在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为Mon1A的功能的研究提供了帮助。本发明专利技术还提供了一种上述稳定敲低Mon1A的细胞系的构建方法。

【技术实现步骤摘要】
稳定敲低MonIA的细胞系及其构建方法
本专利技术涉及细胞学领域，尤其涉及一种稳定敲低MonlA的细胞系及其构建方法。
技术介绍
连续的从初级内体向次级内体的转变需要协调小GTP酶Rab5和Rab7活性。初级内体向次级内体的转变可能是通过转运载体也可能是通过内体上丢失Rab5同时获得Rab7这样的Rab蛋白的转变所调控的，在线虫内的研究证明了后一种的调控方式。此外，后来研究表明在后生动物中SAND-1/MonlA是Rab蛋白转变的临界开关。SAND-1在这一过程中有着双重的作用。首先，它通过将RABX-5从内吞小体的膜上去除来阻断对RAB-5活性是正反馈调节；其次，它加倍了对RAB-7的募集，很可能是通过与同一膜上的HOPS复合物相互作用完成。因而SAND-1/MonlA调控着RAB-5和RAB_7GEFs的分布而成为RAB-5和RAB-7的转换开关。胞外物质在细胞膜上的内陷处被包裹从而被吸收进入细胞。这些内陷无论是管状还是小泡结构都是通过一种分裂方式进而从质膜上释放到胞内的。这些内吞的产物与初级内体融合，而初级内体是被其所带有的一种小GTP酶Rab蛋白家族的Rab5以及Rab5效应蛋白(例如EEAl和磷酸肌醇激酶Vps34)所标记的。初级内体也被认为是分选内体，因为蛋白质可以被再循环到质膜，也可以被逮到转运高尔基网，或是成为溶酶体分解的底物。溶酶体的分选牵涉到转运蛋白质到次级内体，也相当于多泡体。次级内体被另外一个小GTP酶Rab家族的Rab7所标记。从初级内体向次 级内体转化的过程因涉及一个关系到Rab5的正反馈调节而十分复杂。Rab5依靠鸟嘌呤核苷酸转换因子(GEF)Rabex5来启动随后的绑定并激活效应分子，如磷酸肌醇激酶Vps34，从而被募集到初级内体上。这样会依次增加与Rab5和更多效应分子的绑定。后来的研究发现了 SAND-1/MonlA是第一个被发现在Rab蛋白转换过程中的重要调节器。SAND-1/MonlA是RAB-5活性是正反馈调节的阻断剂。不仅如此，SAND-1/MonlA的活性驱使Rab7被募集到初级内体上，很可能是通过与Rab7的鸟嘌呤转换因子复合物HOPS相互作用完成的。因此，SAND-1/MonIA是初级向次级内体成熟的转换器。SAND-1/MonlA在脊椎动物里有两个同源物，MonlA和MonlB。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种稳定敲低MonlA的细胞系及其构建方法。—种稳定敲低MonlA的细胞系,包括真核表达载体,所述真核表达载体包括用于抑制MonlA表达的序列。在一个实施例中，所述用于抑制MonlA表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。在一个实施例中，所述细胞系为MCF-7A细胞系。在一个实施例中，所述真核表达载体为pLK0.1质粒。在一个实施例中，所述用于抑制MonlA表达的序列插入到所述pLK0.1质粒的Age I和EcoR I两个酶切位点之间。一种稳定敲低MonlA的细胞系的构建方法，包括如下步骤:构建包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体；将所述包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到所述稳定敲低MonlA的细胞系。在一个实施例中，所述用于抑制MonlA表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。在一个实施例中，所述细胞系为MCF-7A细胞系。在一个实施例中，所述真核表达载体为pLK0.1质粒。在一个实施例中，所述用于抑制MonlA表达的序列插入到所述pLK0.1质粒的Age I和EcoR I两个酶切位点之间。这种稳定敲低MonlA的细胞系,通过抑制MonlA的mRNA的转录，以明显降低MonlA的蛋白表达量。该稳定表达细胞系的建立，不仅成功在体外模拟了乳腺癌细胞MonlA的表达状态为研究MonlA在乳腺癌中的作用提供了模型，而且也为MonlA的功能的研究提供了帮助。【专利附图】【附图说明】图1为原始的pLK0.1质粒的图谱；图2为一实施方式的稳定敲低MonlA的细胞系的构建方法的流程图；图3为western检测MCF-7A MonlA knock-down稳定细胞系蛋白表达量的结果图。【具体实施方式】为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。—实施方式的稳定敲低MonlA的细胞系,包括真核表达载体。真核表达载体包括用于抑制MonlA表达的序列用于抑制MonlA表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。细胞系可以为MCF-7A细胞系，其原始来源为人的乳腺癌细胞，购买自美国菌种保藏中心(ATCC)。真核表达载体可以为pLK0.1质粒。如图1所示，具体来说，用于抑制MonlA表达的序列插入在pLK0.1质粒Age I和EcoR I两个酶切位点之间。。 如图2所示的上述稳定敲低MonlA的细胞系，包括如下步骤。S10、构建包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体。真核表达载体可以为pLK0.1质粒。pLK0.1 载体购自 Open Biosystems 公司。oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司。T4DNA连接酶购自NEB公司。胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自OMEGA公司。质粒大量抽提试剂盒购自Nucleo Bond公司。原始的pLK0.1质粒的图谱如图1所示，将用于抑制MonlA表达的序列插入到Age I和EcoR I两个酶切位点之间,得到包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体。用于抑制MonlA表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。该SEQ ID N0.1序列是根据我们所要抑制的目的基因用软件设计得到的，再根据PLK0.1的说明，用引物退火连接的方法将该序列连入pLK0.1载体中。得到的包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体可以通过PCR后酶切，跑DNA电泳鉴定。S20、将SlO得到的包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到稳定敲低MonlA的细胞系。将包括用于抑制MonlA表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到稳定敲低MonlA的细胞系。 细胞系可以为MCF-7A细胞系。DMEM1640培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂Magetran购自Origene公司；MCF10A细胞用含10%胎牛血清的DMEM1640培养液培养。倒置显微镜为Olympus产品，突光倒置显微镜为Nikon公司产品。确定筛选培养基中合适浓度的G418浓度。G418 的配制:配制 IM HEPES:23.8g HEPES 粉末溶于 100mL ddH20, IONNaOH 调节pH至7.3，过滤除菌，4°C保存，终浓度为lmol/L。制备筛选培养基:用培养基将G418稀释为O μ g/ml, 200 μ g/ml, 300 μ g/ml,400 μ g/ml>500 μ g/ml>600 μ g/ml>700 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定敲低MonlA的细胞系,其特征在于,包括真核表达载体,所述真核表达载体包括用于抑制MonlA表达的序列。2.如权利要求1所述的稳定敲低MonlA的细胞系，其特征在于，所述用于抑制MonlA表达的序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的稳定敲低MonlA的细胞系，其特征在于，所述细胞系为MCF-7A细胞系。4.如权利要求1所述的稳定敲低MonlA的细胞系，其特征在于，所述真核表达载体为pLK0.1 质粒。5.如权利要求4所述的稳定敲低MonlA的细胞系，其特征在于，所述用于抑制MonlA表达的序列插入到所述pLK0.1质粒的Age I和EcoR I两个酶切位点之间。6.一种稳定敲低MonlA的细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，杨诗涵，李红昌，李华顺，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：