一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。具体地，对野生型的阿维菌素产生菌中的aveD基因进行失活，可以获得消除A组分，只产生B组分的菌株；对aveD基因和aveC基因同时失活，并在此基础上回补aveC的同源基因（优选梅岭霉素生物合成基因簇中的meiC基因），获得的突变体发酵产物中95wt%以上都为阿维菌素B2a。将产物阿维菌素B2a作为前体，可以直接用于大量合成高纯度的阿维菌素B1a和伊维菌素。

【技术实现步骤摘要】
一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。
技术介绍
阿维菌素(Avermectin)是一种由革兰氏阳性菌除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius)产生的一类十六元大环内酯类抗生素。阿维菌素是一种高效，无公害的生物农药，具有广谱的杀虫抗螨活性，并且阿维菌素对人畜毒副作用低，体内残留低，这些特点使得阿维菌素在家畜寄生虫感染的治疗和农业病虫害防治方面均有广泛的应用，是生产绿色食品的最佳用药。通常，在阿维菌素发酵过程中，产生A组分(A Ia和A 2a等)和B组分(Bla和B2a等)(见图1)，以Bla组分为最有效成份，而B2a组份通常用作合成另外一种生物农药伊维菌素的前体。以阿维菌素为前体半合成的衍生物依维菌素(Ivermectin)和多拉菌素(Doramectin)具有更高的应用价值，前者将Bla的22为和23位双键换为单键，后者则将Bla的25位的侧链基团换为环己基。 目前阿维菌素和伊维菌素生产上需要从天然发酵产物中加以提纯，处理过程非常复杂，得率低，还需要使用甲苯等有毒溶剂。此外，尚没有发酵产物只有B2a组分的菌株。因此本领域迫切需要开发高产的发酵组份明确单一的阿维菌素产生菌。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种阿维菌素产生菌，所述的产生菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式1:B/A ≥35%式I其中，B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。在另一优选例中，B/A≥40%,更佳地≥50%,更佳地≥60%,更佳地≥70%,更佳地≥80%，更佳地≥ 90%，更佳地≥95%，最佳地≥ 99%。在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌为链霉菌属。在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌为除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius)。在另一优选例中，所述产生菌的基因组中的aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能。在另一优选例中，所述AveD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在另一优选例中，所述产生菌的基因组中aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或AveC蛋白无功能；并且，所述产生菌的基因组中含有或表达aveC的同源基因；或所述产生菌中表达AveC蛋白的同源蛋白。在另一优选例中，所述AveC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。在另一优选例中，所述aveC的同源基因选自下组:美贝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克马丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅岭霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。在另一优选例中,所述的aveC的同源基因为梅岭霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。在另一优选例中，所述的milC基因来源于冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)。在另一优选例中，所述的nemC基因来源于蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseus)。在另一优选例中，所述的meiC基因来源于南昌链霉菌Streptomycesnanchangensisο在另一优选例中，梅岭霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:3所示。在另一优选例中，所述的阿维菌素产生菌是除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius) mVLlOO3,保藏编号为 GCMCC N0.6678。在本专利技术的第二方面，提供了第一方面所述的阿维菌素产生菌的用途它被用做发酵生产阿维菌素B2a组分的工程菌。在本专利技术的第三方面，提供了一种制备阿维菌素B2a组分的方法，包括步骤:(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a的发酵产物；和(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分。在本专利技术的第四方面，提供了一种生产阿维菌素Bla组分的方法，包括步骤:(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和(c)将分离的阿维菌素B2a转化为阿维菌素Bla组分。在另一优选例中，步骤(C)所述转化是将B2a组分高温水解，从而获得Bla组分。在本专利技术的第五方面，提供了一种生产伊维菌素的方法，包括步骤:(a)培养第一方面所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a组分的发酵产物；(b)从发酵产物中分离出所述的阿维菌素B2a组分；和(c)将分离的阿维菌素B2a组分转化为伊维菌素。在另一优选例中，步骤(C)所述转化是用三-正-丁基氢化锡对阿维菌素B2a进行还原和脱保护，获得伊维菌素。在本专利技术的第六方面，提供了一种制备阿维菌素产生菌的方法，包括步骤:(I)对生产伊维菌素的出发菌进行aveD基因和或AveD蛋白的遗传改造，从而获得基因组中aveD基因失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能的阿维菌素产生菌；并且，在所述生产伊维菌素的出发菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式II:B/A < 35%式II其中，B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量；A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤:(2)对步骤(1)获得的菌株，对aveC基因和或AveC蛋白进行进一步的遗传改造，从而获得基因组中aveC基因失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失、或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或表达的AveC蛋白无功能的阿维菌素产生菌；以及(3)对步骤⑵获得的菌株，回补aveC的同源基因或AveC同源蛋白。在本专利技术的第七方面，提供了一种基因组合，所述的基因组合与出发(或原始)的生产伊维菌素的基因组合相比，具有选自下组的一个或多个特征:(I)所述基因组合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因；或(2)所述基因组合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因；并且，含有或表达aveC的同源基因。在本专利技术的第七方面，提供了一种载体，所述的载体上整合有第六方面所述的基因组合。在本专利技术的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第七方面所述的载体，或所述的宿主细胞整合有第六方面所述的基因组合。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。【专利附图】【附图说明】下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示了阿维菌素8个组分的化学结构。图2显示了不同菌株发酵产物HPLC分析结果；1为出发菌株发酵产物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阿维菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，阿维菌素B2a组分的相对含量满足式1:B/A ≥ 35% 式I 其中， B为发酵产物中阿维菌素B2a组分的质量； A为发酵产物中所有阿维菌素组分总的质量。2.如权利要求1所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中的aveD基因被失活、或aveD基因功能丧失、或aveD基因缺失、或不表达aveD基因、或不表达AveD蛋白、或表达的AveD蛋白无功能。3.如权利要求2所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中aveC基因被失活、或aveC基因功能丧失、或aveC基因缺失；或不表达aveC基因、或不表达AveC蛋白、或AveC蛋白无功能；并且， 所述产生菌的基因组中含有或表达aveC的同源基因；或所述产生菌中表达AveC蛋白的同源蛋白。4.如权利要求3所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，所述aveC的同源基因选自下组:美贝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克马丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅岭霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。5.如权利要求1所述的阿维菌素产生菌，其特征在于，它是除虫链霉菌(Streptomycesavermectinius)mVL1003，保藏编号为 CGMCC N0.6678。6.权利要求1中所述的阿维菌素产生菌的用途，其特征在于，它被用做发酵生产阿维菌素B2a组分的工程菌。7.一种制备阿维菌素B2a组分的方法，其特征在于，包括步骤: (a)培养权利要求1所述的阿维菌素产生菌，从而获得含有阿维菌素B2a的发酵产物；和 (b)从发酵产物中分离出所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，赵群飞，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，中国科学院上海有机化学研究所湖州生物制造创新中心，
类型：发明
国别省市：