本发明专利技术提供了一种新型的碱性脂肪酶突变体，并通过构建黑曲霉工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达4429U/mL。与野生型相比，所述脂肪酶突变体作用pH更宽泛，耐热性和热稳定性更强，有利于该酶及含酶产品的后处理及贮存。所述脂肪酶突变体可广泛应用于洗涤剂中，在相同添加量的情况下，含脂肪酶突变体的洗涤剂对皮脂污布的洗涤效果要显著高于含野生型脂肪酶的洗涤剂，前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
一种碱性脂肪酶突变体
本专利技术属于功能基因改造与筛选
，具体涉及一种碱性脂肪酶体突变体及其应用。
技术介绍
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。它是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的一个显著特征是它不同于多数水解酶的催化特性，它是一类非水相酶，其催化反应是在油水界面上进行，对于水溶性底物不起催化作用。不同来源的脂肪酶作用于底物甘油三酯的酯键位置不同。脂肪酶作为一种重要的工业用酶，可以催化水解、酯合成、酯交换、转酯化等一系列反应，因此在食品、皮革、饲料、洗涤、医药、油脂、化工等传统工业领域应用广泛。从二十世纪开始，美国等国家就开展了对碱性脂肪酶的研究，并不断推出市场化产品，然而，国内对碱性脂肪酶的研究起步较晚，在碱性脂肪酶发酵菌种、酶学性质、酶活性以及应用效果等方面与国外的先进技术有很大的差距，这样不利于产品的后处理及长期稳定存放，更影响了其产业化、市场化发展。因此，急需开发新的酶学性质优良、产量高的碱性脂肪酶，提高洗涤效果，并降低生产成本，从而促进碱性脂肪酶的广泛应用。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种新型碱性脂肪酶突变体及其在洗涤剂中的应用。本专利技术通过大量随机突变的筛选，得到一种耐热性、热稳定性均显著提高的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的黑曲霉工程菌，从而为该突变体的广泛应用奠定基础。本专利技术一个方面涉及一种碱性脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID N0:1的脂肪酶的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg。上述碱性脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4o本专利技术另一方面涉及携带有编码序列为SEQ ID NO:4的碱性脂肪酶突变体基因的重组质粒。本专利技术还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。所述工程菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。本专利技术的碱性脂肪酶突变体用于制备洗涤剂。本专利技术提供了一种新型的碱性脂肪酶突变体，并通过构建黑曲霉工程菌高效体外表达该脂肪酶突变体，发酵酶活高达4429U/mL。该脂肪酶突变体的最适作用pH为9.5，在PH7.0,9.0,11.0条件下的相对酶活显著高于野生型，作用pH更为宽泛；最适作用温度为35°C，在25-35°C、50-60°C范围内，脂肪酶突变体的相对酶活显著高于野生型，尤其在55°C条件下突变体的相对酶活比野生型提高了约20%，耐热性更强；此外，脂肪酶突变体的热稳定性显著高于野生型，更有利于该酶及含酶产品的后处理及贮存。所述脂肪酶突变体可广泛应用于洗涤剂中，在相同添加量的情况下，含脂肪酶突变体的洗涤剂对皮脂污布的洗涤效果要显著高于含野生型脂肪酶的洗涤剂，前景广阔。【专利附图】【附图说明】图1:黑曲霉IipN和黑曲霉lipN-ml菌株发酵液SDS-PAGE电泳图；其中，箭头所指32kD处，即为重组表达的碱性脂肪酶。图2:脂肪酶突变体IipN与野生型lipN-ml相对酶活-pH变化曲线。图3:脂肪酶突变体IipN与野生型lipN-ml相对酶活-温度变化曲线。图4:脂肪酶突变体IipN与野生型lipN-ml自身热稳定性变化曲线。【具体实施方式】下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发 明。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。实施例1:碱性脂肪酶基因的随机突变筛选根据NCBI上公布的一种脂肪酶(命名为IipN)的基因序列SEQ ID NO:1 (GeneBankAF054513)，在其起始密码子ATG前增加9个碱基CTTAAGAGG(下划线所示为AflII酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加AGGTCTAGA (下划线所示为XbaI酶切位点)，然后将此序列交由上海生工生物工程股份有限公司根据黑曲霉密码子偏好性进行密码子优化，并由该公司进行合成。用限制性内切酶AfIII和XbaI (Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化入Trans5 α大肠杆菌(Transgen),用氨节青霉素进行选择。为确保准确,对若干克隆进行测序(Invitrogen),测序结果显示，本专利技术获得的DNA序列为SEQ ID NO: 2，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO:1。使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得I个重组质粒，命名为pGm-lipN。为了改善上述碱性脂肪酶IipN自身的热稳定性， 申请人:通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物lip-F、Iip-R如下:lip-F:AAACTTAAGATGCGGTCCTCCCTGG (下划线为限制性内切酶 AflII 识别位点)Iip-R:AGGTCTAGATCACAGACAGGTGCCG (下划线为限制性内切酶 XbaI 识别位点)以序列为SEQ ID NO:2的核苷酸片段为模板，使用上述的引物(lip_F、lip_R)，采用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增获得随机突变的碱性脂肪酶扩增产物，扩增后胶回收PCR产物，AflII, XbaI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，370C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有碱性脂肪酶突变体的大肠杆菌细胞裂解液。分别取出30 μ I裂解液至两块新的96孔板，分别在55°C下测定其脂肪酶酶活。结果发现有些突变体在高温条件下碱性脂肪酶活性显著降低甚至完全没有活性，而有些突变体碱性脂肪酶活性保持不变或者升高。挑选55°C条件下碱性脂肪酶活性最高的突变体进行DNA测序，最终获得了能显著提高脂肪酶IipN耐热性的突变位点组合E78R和D187R。含E78R和D187R两点突变的脂肪酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。与SEQ ID NO:1的脂肪酶相比，E78R脂肪酶突变体的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg，正是由于这两个位置的改变导致突变体的酶学性质发生了变化。将合成的脂肪酶突变体基因命名为lipN-ml，用引物lip_F、Iip-R进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种碱性脂肪酶突变体，其特征在于，所述的脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO:1的脂肪酶的第78位氨基酸由Glu变为Arg，第187位氨基酸由Asp变为Arg。2.如权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体，其氨基酸序列为SEQID N0:3。3.一种编码权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体的基因，其核酸序列为SEQ ID N0:4。4.一种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的碱性脂肪酶突变体的重组质粒。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：王华明，徐娟，吴秀秀，黄亦钧，
申请(专利权)人：通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物lipF，IipR如下，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。