从样品的一或多种杂质中纯化靶蛋白的方法技术

本发明专利技术至少部分地涉及蛋白质纯化的改进方法。具体地，本发明专利技术至少部分地涉及用于从包括含Fc区域的蛋白质和一或多种杂质的组合物中纯化含Fc区域的蛋白质的方法，其中所述方法不需要存储罐和/或缓冲液交换步骤。

Method for purifying target proteins from one or more impurities in a sample

The invention relates, at least in part, to improved methods for protein purification. Specifically, the invention relates to a method for at least part of the protein containing region of Fc purified from Fc containing composition including protein and one or more impurities, wherein the method does not require storage tank and / or buffer exchange steps.

【技术实现步骤摘要】
从样品的一或多种杂质中纯化靶蛋白的方法本专利技术是申请日为2010年8月5日，申请号为201080035153.X，标题为“从样品的一或多种杂质中纯化靶蛋白的方法”的专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2009年8月7日提交的美国临时专利申请第61/273,709号的优先权权益，其全部内容援引加入本申请。
本专利技术至少部分涉及蛋白质纯化方法。具体地，本专利技术至少部分涉及用于从包含靶蛋白和一或多种杂质的组合物中纯化靶蛋白的方法，所述靶蛋白为例如含Fc区域的蛋白质，如抗体或其片段和抗体样分子，如免疫粘附素。
技术介绍
生物技术和制药工厂越来越认识到对诸如包括抗体在内的治疗性蛋白等蛋白质进行高效和经济的大规模纯化的重要性。通常，蛋白质纯化的方法极其烦琐且昂贵，并包括许多不同的步骤。例如，通常使用细胞培养法来制备蛋白质，例如通过插入含目标蛋白基因的重组质粒，使用工程化的哺乳动物细胞或细菌细胞系来制备目标蛋白。通常，要面对的巨大挑战是如何将所希望的蛋白质从加入到细胞的培养基组分和细胞本身的副产物以及可能存在的任何其它杂质中分离。当欲将治疗性蛋白用于人且必须经过食品和药品管理局许可时，这类分离就特别的重要。通常，目前所用的纯化方法包括至少以下步骤：细胞裂解以回收细胞内蛋白或在分泌蛋白的情况下从培养基中回收蛋白质；通过差示离心或过滤去除细胞碎屑以获得含目标蛋白的净化样品；在多步骤工艺中使用各种色谱介质以从样品的各种杂质中分离目标蛋白。常用的色谱法包括亲和色谱介质、离子交换色谱介质、疏水性相互作用、亲水性相互作用、尺寸排阻和混合模式(即多种色谱法的组合)中的一或多种。例如，对于单克隆抗体的纯化，已描述了许多方法，大部分方法包括起始的蛋白A亲和捕获步骤，和随后的一或多种离子交换精制步骤(polishingsteps)。而且，可使用其它色谱技术，例如：结合和洗脱疏水性相互作用色谱(HIC)；流过式疏水性相互作用色谱(FTHIC)；混合式色谱技术，如结合和洗脱弱阳离子和阴离子交换(Abx)、结合和洗脱疏水性和离子交换相互作用、和流过式疏水性和离子交换混合式相互作用(FTMM)，它们均可使用诸如CaptoAdhere、CaptoMMC、HEAHypercel、PPAHypercel等树脂。此外，可使用疏水性电荷诱导(HCI)色谱以及其它技术和多种技术的组合来进行精制。通常，包括能提供额外正交的病毒去除步骤的阴离子交换步骤对精制步骤很重要。如上所述，虽然已描述了涉及各种色谱步骤组合的蛋白质纯化方法，但这些方法需要在每个色谱步骤之间使用存储罐(holdingtank)和/或缓冲液交换步骤。通常，将靶蛋白洗脱入存储罐，在存储罐中调节缓冲液/溶液条件，以使它们适用于下一个色谱步骤(称为缓冲液交换)。在被上样至下一个色谱介质或过滤膜之前，通常根据需要来调节存储罐中缓冲液的条件，如pH、盐等。
技术实现思路
本专利技术至少部分涉及从一或多种杂质中纯化或分离目标蛋白的改进方法，其中所述方法不需要各个色谱步骤之间的存储罐和/或缓冲液交换步骤。在各个实施方式中，本专利技术提供了通过强力模板纯化含Fc区域的蛋白质(如单克隆抗体和类似蛋白)，而避免了中间的存储罐或缓冲液交换步骤。因此，可将所述纯化方法称为“连续方法”。所述方法包括使用适合的条件和色谱介质来实现连续的、无存储罐的方法。在本专利技术的一些实施方式中，提供了从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)使所述样品接触亲和色谱介质；(b)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述亲和介质洗脱；(c)使洗脱液接触阳离子交换色谱介质；(d)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述阳离子交换色谱介质洗脱；(e)使洗脱液接触阴离子交换色谱介质；和(f)回收所述含Fc区域的靶蛋白，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间以及步骤(d)和(e)之间不需要存储罐。在本专利技术其它实施方式中，提供了从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)使所述样品接触亲和色谱介质；(b)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述亲和介质洗脱；(c)使洗脱液接触阳离子交换色谱介质；(d)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述阳离子交换色谱介质洗脱；(e)使洗脱液接触阴离子交换色谱介质；和(f)回收所述含Fc区域的靶蛋白，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间以及步骤(d)和(e)之间不需要缓冲液交换步骤。在本专利技术其它实施方式中，提供了从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)使所述样品接触亲和色谱介质；(b)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述亲和介质洗脱；(c)使洗脱液接触阳离子交换色谱介质；(d)将所述含Fc区域的靶蛋白从所述阳离子交换色谱介质洗脱；(e)使洗脱液接触阴离子交换色谱介质；和(f)回收所述含Fc区域的靶蛋白，其中所述方法在步骤(b)和(c)之间以及步骤(d)和(e)之间不需要存储罐和缓冲液交换步骤。在所要求保护专利技术的方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括在步骤(a)和(b)之间的预洗脱步骤。在多个实施方式中，所述预洗脱步骤包括使步骤(a)的亲和色谱介质接触阳离子交换色谱缓冲液。在多个实施方式中，所要求保护的方法可用于从一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白。此类含Fc区域的靶蛋白包括但不限于抗体、免疫粘附分子和Fc融合蛋白、以及它们的含Fc的片段。在具体实施方式中，含Fc区域的靶蛋白为单克隆抗体。在多个实施方式中，使用pH2.0-4.0的缓冲液将含Fc区域的靶蛋白从亲和介质中洗脱。在一些实施方式中，步骤(d)包括使用pH5.0-9.0的缓冲液。在其它实施方式中，步骤(d)包括使用pH6.0-8.0的缓冲液。在一些实施方式中，本专利技术方法中的亲和色谱介质步骤包括使用蛋白A或其功能性变体。在一些实施方式中，本专利技术的方法进一步包括在步骤(c)和(d)之间的病毒灭活步骤。在一些实施方式中，所述病毒灭活步骤包括使所述阳离子交换色谱介质与pH小于4.0的缓冲液接触适合于病毒灭活的一段时间。所述时间通常为15至60分钟。本专利技术还提供了用于从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的试剂盒。在一些实施方式中，这类试剂盒包括以下一或多种：亲和色谱柱、阳离子交换色谱柱、阴离子交换色谱柱和一或多种洗脱缓冲液以及试剂盒使用说明书。在一些实施方式中，试剂盒中所包括的一或多种色谱柱是一次性的。附图说明图1描述了在多种pH条件下将样品上样至阳离子交换柱的色谱图。图2描述了SDS-PAGE实验的结果，其中样品在非还原性条件下分析，如实施例3所详述。全部泳道中的优势带表示IgG。完整的IgG在约175kDa处可见。150kDa、100kDa、75kDa、40kDa和20kDa处的其它带来自部分还原的IgG、未组装的IgG或IgG片段。图3示意性描述了修改的Akta(即色谱工作站或系统)，其显示用于在线(in-line)三步法的柱管道装置(plumbing)。图4描述了将蛋白A亲和介质直接上样至阳离子交换柱上的色谱图。图5描述了将蛋白A亲和捕获步骤的2个循环产物上样至单个在线阳离子交换柱上的色谱图。图6描述了将蛋白A亲和捕获步骤的4个循环产物上样至单个在线阳离子交换柱上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含：亲和色谱介质、阳离子交换色谱介质、阴离子交换色谱介质、pH低于4.0且电导率为5‑50mS的缓冲液和一或多种洗脱缓冲液，以及无需存储罐和/或缓冲液交换步骤而使用所述试剂盒的说明书，所述说明书显示使用所述亲和色谱介质、阳离子交换色谱介质、阴离子交换色谱介质、pH低于4.0且电导率为5‑50mS的缓冲液和一或多种洗脱缓冲液的顺序和条件。

【技术特征摘要】
2009.08.07 US 61/273,7091.用于从样品的一或多种杂质中纯化含Fc区域的靶蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含：亲和色谱介质、阳离子交换色谱介质、阴离子交换色谱介质、pH低于4.0且电导率为5-50mS的缓冲液和一或多种洗脱缓冲液，以及无需...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·索伊斯，J·D·哈伯德，Y·张，J·海姆齐克，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：美国,US