一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位、抗体的制备及其应用，所述抗原表位序列如SEQ ID NO.1或2所示。所述抗原表位可以被JS‑2012毒株(野生毒株)的单克隆抗体所识别，但不与Bartha‑K61毒株(疫苗株)和Vero细胞的单克隆抗体发生反应。所述抗原表位在伪狂犬病病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得伪狂犬病病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。

Antigen epitope of pseudorabies virus gE protein, preparation and application of antibody

The invention discloses a pseudorabies virus epitope of the gE protein, preparation and application of antibody, the antigen epitope sequences such as SEQ NO.1 or ID 2 shows. The epitope can be JS 2012 strains (wild strain) monoclonal antibody recognition, but not with the Bartha K61 strain (vaccine strain) monoclonal antibody and Vero cell reaction. The antigen epitopes using the pseudorabies virus antibody drug detection reagent, the application of the pseudorabies virus antibody antigen can be used by ordinary chemical synthesis preparation method, compared with gene engineering expression protein as diagnostic antigen, antigen synthesis process is simple, high purity.

【技术实现步骤摘要】
一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用
本专利技术属于生物
更具体涉及一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位、抗体的制备及应用。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起多种动物发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种急性烈性传染病，又称Aujeszky’s病。PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，双链线状DNA病毒。猪是该病原的主要宿主和传染源，成年猪大多为隐性感染，仔猪发病主要表现为发热，食欲不振，精神萎靡，伴有明显的神经症状。妊娠母猪感染会导致流产，产死胎及木乃伊胎。随着养殖业的规模化发展，该病的发生及流行日趋严重，症状愈专利技术显。该病也给全世界养猪业带来了极大的经济损失。伪狂犬病毒的gE基因位于US区，全长1.7kb，是伪狂犬病毒的主要毒力基因之一。伪狂犬病自我国发现以来一直在猪群中流行，gE基因缺失活疫苗的广泛使用使得该病得到了有效控。但由于伪狂犬病有着高度的潜伏感染特性，易在体内外环境变化的应激下爆发疫情。gE-ELISA配合gE基因缺失疫苗使用，能用血清学方法鉴别出疫苗接种猪和野毒感染住，对于伪狂犬病的防控与净化具有重要意义。随着2011年伪狂犬病在中国爆发，伪狂犬病毒毒力增强，传统疫苗不能对新出现的变异毒株提供完全保护，这提示单纯使用疫苗不可能根除伪狂犬病。为了有效控制直至根除伪狂犬病，需建立一种有效快速的血清学诊断方法以区分野毒株感染猪与疫苗免疫猪。而现有技术中并没有相关抗体的研究，也并没有相关抗原表位的研究，从而导致无法有效的区分野毒株感染猪与疫苗免疫猪。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位，所述抗原表位为：编码2E5抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.1：RLRRE所示，定位在161-165AA。编码5C3抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.2：EMGIGDY所示，定位在148-154AA。所述抗原表位可以被JS-2012毒株(野生毒株)的单克隆抗体所识别，但不与Bartha-K61毒株(疫苗株)和Vero细胞的单克隆抗体发生反应。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位在伪狂犬病病毒抗体药物检测试剂中的应用，该应用使得伪狂犬病病毒抗体诊断抗原可以用普通化学合成方法制备，相比基因工程表达蛋白做为诊断抗原，合成抗原工艺简便，纯度更高。为了实现上述的目的，本专利技术通过以下技术措施实现.一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位的制备方法，其步骤是：A、利用分子生物学对gE主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建。B、将重组蛋白的诱导表达与纯化，C、利用纯化蛋白进行小鼠免疫，获得杂交瘤细胞和单克隆抗体。D、单克隆抗体的稳定性和特异性检测。E、获得上述特异性单克隆抗体的抗原表位，并对其进行鉴定。一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位在制备治疗或预防伪狂犬病病毒ELSIA抗体药物检测(试剂盒)中的应用，其步骤是：1、以获得的抗原表位作为参考化学合成抗原。2、以合成抗原制备试剂盒主要组分抗原包被板。3、按常规方法制备试剂盒其他组分。4、使用试剂盒检测血清中狂犬病病毒抗体。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1、本专利技术的抗原表位是由针对JS-2012株的特定单抗筛选而来，具有极高的特异性和稳定性。2、与现有的灭活病毒抗原或基因表达抗原技术相比，生产过程中不涉及菌种和毒株，工艺安全有保障，不会对环境造成污染。3、利用获得的抗原表位合成肽抗原与基因工程表达抗原相比，生产周期短，易纯化且纯度较高。4、本专利技术适合大规模的临床血清检测，反应时间短，2小时即可出结果。5、本专利技术试剂盒与其他病毒阳性血清无交叉反应，敏感性高，特异性好。6、本专利技术试剂盒操作简便，与伪狂犬病病毒正向间接血凝试剂盒符合率高。附图说明图1为gE基因扩增和重组质粒pCold-gE酶切鉴定，其中，A：gE基因的PCR扩增.1：gE基因PCR扩增结果；2：阴性对照；M：DNA分子量标准B：重组质粒pCold-gE酶切鉴定.1：pCold-TF质粒EcoRI酶切；2：pCold-gE质粒EcoRI酶切；M：DNA分子量标准。图2为gE重组蛋白的表达与纯化，其中，1：纯化的重组gE蛋白；2：IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物上清；3：IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物沉淀；4：IPTG诱导的pCold-TF转化菌；M：蛋白质分子量标准.图3为IFA鉴定gE蛋白单克隆抗体的特异性。图4为gE蛋白单抗的Westernblot鉴定，其中，1：PRVJS-2012感染的Vero细胞；2：PRVBarthaK61感染的Vero细胞；3：未感染的Vero细胞图5为gE2E5鉴定表位示意图，其中A为鉴定第1轮，B为鉴定第2轮，C为鉴定第3轮。图6为gE5C3鉴定表位示意图，其中A为鉴定第1轮，B为鉴定第2轮，C为鉴定第3轮。具体实施方式实施例1：材料与方法毒株、细胞和实验动物伪狂犬病病毒JS-2012株，Bartha-K61株，SP2/0骨髓瘤细胞，PK-15，Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。细胞均在37℃，5％CO2和10％FBS(FBS，Sigma，Shanghai，China)条件下培养。BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。载体、试剂和菌株pCold-TF载体，大肠杆菌BL21(DE3)购自Takara(上海)公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购于Sigma(上海)公司；核酸内切酶EcoRI购自NEB(上海)公司。实施例2：gE主要抗原表位的扩增、蛋白制备gE主要抗原表位区域基因的扩增与重组质粒的构建根据NCBI发表的PRV(JS-2012)gE基因序列(序列号：KP257591.1)，设计特异性引物扩增gE基因第151-750位核苷酸。上游引物gE-F：5’-accctcgagggatccgaattcATGACCGAGGCCGACGAC-3’(SEQIDNO.3)；下游引物gE-R：5’-caggtcgacaagcttgaattcTTAGACCACGCGCGGCAT-3’(SEQIDNO.4)。小写部分是与pCold-TF进行同源重组的同源臂序列，扩增产物为600bp。按照天根DNA小量提取试剂盒说明书提取PRV(JS-2012)DNA(-20℃保存)，用PrimestarHS(Takara)高保真酶扩增gE部分基因。PCR扩增程序：95℃5min；98℃10s，68℃10s，72℃1min(35个循环)；72℃10min。将PCR产物通过同源重组(诺唯赞)的方法，与pCold-TF载体多克隆位点的相应位置重组，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-gE。PCR扩增得到了伪狂犬病毒gE基因约600bp的片段(图1A)，PCR产物经凝胶电泳分离，将目的片段纯化回收并克隆到pCold-TF表达载体中。重组质粒酶切鉴定结果显示，阳性质粒出现与预期大小一致的片段(图1B)。测序结果显示阳性质粒携带目的基因与预期序列一致，阳性质粒pCold-gE可以用于下一步的试验研究。重组蛋白的诱导表达与纯化将重组质粒pCold-gE转化到B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以被JS‑2012毒株(野生毒株)的单克隆抗体所识别，但不与Bartha‑K61毒株(疫苗株)和Vero细胞的单克隆抗体发生反应。

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位，所述抗原表位可以被JS-2012毒株(野生毒株)的单克隆抗体所识别，但不与Bartha-K61毒株(疫苗株)和Vero细胞的单克隆抗体发生反应。2.如权利要求1所述的一种伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位，所述抗原表位为：编码2E5抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.1：RLRRE所示，定位在161-165AA。编码5C3抗原表位的短肽，序列如SEQIDNO.2：EMGIGDY所示，定位在148-154AA。3.一种抗体制剂，所述抗体制剂包含特异性针对权利要求1或2中所述的伪狂犬病病毒gE蛋白的抗原表位的抗体，优选的为至少两种抗体，所述抗体是多克隆或单克隆的；或所述制剂包含所述抗体的片段。4.权利要求3所述的抗体制剂，所述抗体制剂可以有效的治疗或预防伪狂犬病病毒。5.一种制备抗血清的方法，所述方法包括将权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，李国新，武吉强，徐晶晶，童武，郑浩，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31